근원세포와 근관세포의 Creatine kinase의 분포 비교

소개

MB와 MT의 단백질 중 creatine kinase(CK)를 검출하기 위한 실험.
Western blotting.

목차

결과 및 토의 / Results and discussion
1. 결과사진첨부.
2. Transfer를 한 후 단백질이 잘 이동되었는지 확인 할 수 있는 방법에 대해 서술하시오.
3. 면역발색 결과 여러 band가 나왔다. 우리가 검출하기 위해 사용했던 항체가 인식하는 단백질과 다른 크기의 band는 어떻게 설명할 수 있을까? 또, 이것을 줄일 수 있는 방법에 대해 설명하시오.
4. 면역발색 결과 검출된 신호의 강도가 낮았다. 가능성 있는 원인은 무엇이고 해결방법을 생각하여 서술하시오.
참고문헌

본문내용

2. Transfer를 한 후 단백질이 잘 이동되었는지 확인 할 수 있는 방법에 대해 서술하시오.
Transfer가 제대로 되었는지 확인하기 위해 transfer한 gel을 염색하거나 membrane을 ponceau염색하기도 한다. 전사가 완료되어지면, membrane을 Ponceau S로 염색하고 전사가 잘 되었는지를 확인함과 동시에 분자량 marker단백질의 위치를 조사한다. 염색에는 이 외에도 여러 가지 방법이 있지만, Ponceau S는 가역적으로 단백질과 결합하고 용이하게 탈색되어지기 때문에 marker의 land만을 자를 필요가 없으므로, 조작이 간단하다. Ponceau S는 자줏빛 붉은색이며 transfer가 제대로 되었는지 확인할 때, membrane 위에 뿌리면 protein band가 붉은색으로 나타난다. 이것은 DW로 destaining하면 곧 사라진다. 탈색이 잘 되면 항체와의 반응에는 영향을 미치지 않는다. 검출감도는 gel을 CBB로 하는 것보다 다소 낮다.
Prestain marker를 사용하면 염색하지 않아도 marker가 잘 보여지기 때문에 편리하지만, marker의 분자량이 언제나 정확하지는 않을 수도 있으며, 밴드도 확실히 보여지지 않는 경우가 있다. Ponceau S를 사용하는 방법에서는 상기와 같은 점은 걱정할 필요가 없고 조작도 간단하며, 무엇보다도 sample의 각 lane의 단백질의 양이나 pattern을 확인하는데 이점이 있으나 일반적으로 고가의 제품이기 때문에 잘 사용하지 않는다.[1]

3. 면역발색 결과 여러 band가 나왔다. 우리가 검출하기 위해 사용했던 항체가 인식하는 단백질과 다른 크기의 band는 어떻게 설명할 수 있을까? 또, 이것을 줄일 수 있는 방법에 대해 설명하시오.
시료의 준비과정에서 단백질이 제대로 정제되지 않았을 수 있다. 이럴 경우 표적단백질이 아닌 다른 단백질 중에 유사하게 항체와 결합하는 단백질이 있다면 다른 band가 나타나게 된다. 시료를 준비하는 것부터 해야 할 것이다.

참고자료

· 1.단백질실험노트 하. 2001. 김승호 외 공역. 월드사이언스. 24~40p
· 2.Stryer 생화학 상. Lubert stryer. 1999. 박인원 외 공역. 서울외국서적. 63~64p
· 3.면역생물학 5판. Charles.A.J. 2002. 김태규 외 공역. 라이프사이언스. 668p
· 4.Lehningers 생화학 상. 1986. 이동기. 유한문화사. 417p
· 5.Lehningers 생화학 3판 하. 2002. 김선희 외 공역. 서울외국서적. 525p