FLAG 펩타이드에 특이적인 MassM2 single-chain variable fragment (ScFv) 항체의 개발 (The development of MassM2 single-chain variable fragment (ScFv) antibody specific to FLAG peptide)

서지정보

· 발행기관 : 한국미생물학회
· 수록지 정보 : 미생물학회지 / 58권 / 4호 / 238 ~ 244페이지
· 저자명 : 김진규

초록

FLAG 펩타이드(DYKDDDDK) 항원에 특이적인 항-FLAGM2 생쥐 단일클론 항체는 FLAG tagged 단백질을 정제하거나검출하는데 전 세계적으로 널리 사용되고 있다. 그러나 이 항체의 항원 결합에 관여하는 아미노산 서열은 알려져 있지 않았었다. 최근에 항원 결합 부위인 가변 도메인(variable domain) 의 아미노산 서열이 X선 결정학 및 질량 분광학을 통해 결정되었다. 그러므로 본 연구에서는 위에서 언급한 두 가지 방법으로 결정된 항-FLAG-M2 항체의 중사슬(VH) 및 경사슬(VL) 가변 도메인의 아미노산 서열을 정렬하여 MassM2로 명명된중사슬(VH) 및 경사슬(VL) 가변 도메인의 아미노산 서열을새롭게 결정하였다. 또한 AlphaFold라는 컴퓨터 모델링 프로그램으로 예측한 MassM2 3차원 구조와 이미 보고된 2G60 (항-FLAG-M2 항체 결정 구조) 구조를 중첩하여 RMSD (Root Mean Square Deviation)를 계산하여 구조적 유사도 비교를 수행하였다. 새롭게 결정된 MassM2 항체 가변 도메인의 중사슬(VH) 및 경사슬(VL) 아미노산 서열에 따라 해당 유전자를 설계 및 합성하여 pUC119 발현 벡터에 클로닝한 다음 대장균에서 재조합 MassM2 single chain variable fragment (ScFv) 항체로 발현시켰다. 발현된 항체는 enzyme-linked immunosorbent assay와 Western blot에서 FLAG 펩타이드와 FLAG 펩타이드tagged 단백질에 대해 모두 항원결합력을 나타내었다. 또한bio-layer interferometry을 통해 해리평형상수(KD)가 1.12 × 10-8 M~1.342 × 10-7 M으로 계산되어 항원결합력을 재확인할수 있었다.

영어초록

An anti-FLAG-M2 mouse monoclonal antibody specific to the FLAG peptide (DYKDDDDK) is widely used worldwide to purify or detect FLAG-tagged proteins. However, the amino acid sequences involved in antigen binding was unknown.
Recently, the amino acid sequences of the variable domain, which is involved in the antigen binding, has been determined through X-ray crystallography and Mass spectroscopy. Therefore, in this study, the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains named as MassM2 were newly redesigned by aligning the amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains determined by two methods mentioned above. In addition, the MassM2 three-dimensional structure predicted by computational modeling program called as AlphaFold and the already reported 2G60 crystal structure were superimposed to calculate RMSD (Root Mean Square Deviation) for comparison of structural similarity. Depending on the newly determined variable heavy and light chain amino acid sequences of the MassM2 antibody, corresponding genes were designed, synthesized, and cloned into the pUC119 expression vector and then expressed in Escherichia coli as a recombinant MassM2 single chain variable fragment (ScFv) antibody. This antibody showed binding activity to both FLAG peptide and FLAG peptide tagged protein in enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot. In addition, the dissociation equilibrium constant (KD) were calculated as 1.12 × 10-8 M–1.342 × 10-7 M through bio-layer interferometry confirming antigen binding activity.

참고자료

· 없음