초고속 이단계 PCR에 의한 Shiga 독소 타입 1의 신속 검출법 (Rapid Detection for Shiga Toxin Type 1 (Stx1) by Using Two-Step Ultra-Rapid Real-Time (URRT) PCR)

서지정보

· 발행기관 : 한국미생물학회
· 수록지 정보 : 미생물학회지 / 44권 / 3호 / 203 ~ 211페이지
· 저자명 : 김일욱, 강민희, 권순환, 조성학, 윤병수

초록

Shiga 독소 생성 대장균(Shiga toxin-producing Escherichia coli; STEC)을 가장 빠르게 검출할 수 있는 초고속 이단계 PCR 방법을 개발하였다. 검색 대상 유전자는 STEC에서 생성되는 Shiga 독소(Shiga toxin; Stx)를 암호화하고 있는 유전자 stx1이며, 1쌍의 stx 유전자 특이 primer를 사용하여 검출을 수행하였다. 초고속 PCR (Ultra-rapid PCR)은 microchip 기반의 6 μl PCR 용량의 Real-time PCR을 사용하고, PCR 회전의 각 단계 중 혼성과 중합을 한 단계로 하였을 뿐 아니라, 각 단계의 적용시간을 각 1초, 3초(해리, 혼성/중합)가 되게 극단적으로 줄여, 검사소요 시간을 최소화하였다. 35회전의 PCR 진단에 사용된 시간은 6분 38초였으며, 용융온도분석에서 stx1 특이 유전자가 검출되었음을 확인하는 데까지 총 7분 28초가 소요되었다. 또한 민감도 측정에서 3×100 CFU/reaction까지 성
공적으로 검출 가능함이 확인되었고, 용융온도분석에서 이 증폭산물은 일정한 81.42±0.34oC의 용융온도를 갖는 것으로 확인되었다. 이 검사법을 다양한 STEC 균주들에게 적용하여 그 성능을 검증하였으며, 이로써 본 초고속 이단계 PCR 방법은 Shiga 독소 생성 대장균의 초신속 검출에 바로 적용될 수 있을 것으로 기대한다.

영어초록

Rapid detection-method for Shiga toxin type 1 that was produced from Shiga toxin-producing Escherichia coli(STEC) was developed by two-step ultra-rapid real-time (URRT) PCR. The specific primers were deduced from 80 bp stable region of stx type 1 (stx1) gene among various informations of STEC strains. URRT PCR is a microchip-based real-time PCR using 6 μl of reaction volume with extremely short denaturation step and annealing/extension step (1 sec, 3 sec, respectively) in each cycle of PCR. Using the stx1-specific URRT PCR, 35 cycled PCR were finished in time of 6 min and 38 sec, also measured 7 min and 28 sec including melting temperature (Tm) analysis. The detection-limit of stx1-specific URRT-PCR was estimated until 3 colony forming units / PCR with products with stable Tm at 81.42±0.34oC. In the applications to various STEC strains and contaminated genomic DNAs, stx1-specific URRT-PCR were tested and shown that it would be expected an useful method for the rapid detection of stx1-coded STEC strains.

참고자료

· 없음