유독 와편모조류 Pfiesteria Piscicida 탐지 및 정량 분석을 위한 EvaGreen 기반 Real-time PCR기법 개발과 현장 적용 (Development of EvaGreen Based Real-time PCR Assay for Detection and Quantification Toxic Dinoflagellate Pfiesteria Piscicida and Field Applications)

서지정보

· 발행기관 : 한국해양학회
· 수록지 정보 : 바다 / 22권 / 1호 / 31 ~ 44페이지
· 저자명 : 박범수, 주재형, 김묘경, 김주환, 김진호, 백승호, 한명수

초록

독성을 가진 종속영양 와편모조류인 Pfiesteria piscicida는, 크기가 매우 작고, Pfiesteria-like dinoflagellate(PLD)와 같은 형태학적으로 매우 유사한 종들로 인해, 현미경 관찰만으로는 이들을 정확하게 동정하는 것은 불가능하다. 따라서, 본 연구에서는 이러한 한계점을 극복하기 위해 EvaGreen을 기반으로 하는 정량적 real-time PCR기법을 이용하여 P. piscicida의 한국에서의 지리적 분포 및 개체군 변동을 조사하였다. 이를 위해, P. piscicida 종특이적 primer를 리보조말 RNA 유전자 영역중 ITS를 대상으로 제작하였으며, primer의 특이성을 검증하기 위해, BLAST 검색과 목표종과 DNA와 competitive PCR을 통해 제작된 primer의 종특이성을 검증하였다. 이들 primer를 사용하여 real-time PCR기법에 적용한 결과, P. piscicida의 세포수와 Ct값 사이에 유의성이 매우 높은 표준 곡선을 도출하였으며(r2 ≥ 0.998), 융해곡선 역시 하나의 피크(88 oC)를 나타탬으로써, P. piscicida의 ITS 1 영역만을 선택적으로 증폴하는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 연구에서 개발된 real-time PCR기법을 통해, P. piscicida의 정성 및 정량 분석이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 개발된 real-time PCR 기법을 이용하여, 2008년 여름 한국근해에서 P. piscicida의 지리적 분포를 조사한 결과, 총 35개의 정점중 서해에 위치한 목포(1,209 cells L-1)와 김제(21,840 cells L-1), 동해에 위치한 강릉(3 cells L-1)에서 이들의 분포가 확인되었다. P. piscicida의 개체군 동태를 연구하기 위해, 2007년 5월부터 6개월동안 시화호 내 3개의 정점을 조사하였다. 그 결과 상류 기수역인 St. 1에서만 P. piscicida가 탐지되었으며, 이들의 밀도는 여름철에 세차례 피크(peak)를 나타냈다. 이들이 출현하였을때, 염분도는 대체로 낮게 나타났으며(≤ 15 psu), 영양염 농도 조사결과, P. piscicida와 영양염류 사이의 유의적인 상관관계는 관찰되지 않았으나, P. piscicida의 먹이원으로 알려진 미소편모충류의 경우, St. 1에서 이들의 현존량이 높았을때, P. piscicida 밀도가 순차적으로 증가하였으며, 또한 P. piscicida가 증가함에 따라 미소편모충류의 현존량이 급격히 감소하였다. 따라서, 시화호에서의 P. piscicida는 염분도가 낮은 환경을 선호하였으며, 무기 영양염류의 농도보다는 먹이원인 미소편모충류의 현존량의 영향을 받는 것을 알 수 있었다.

영어초록

It is difficult to detect and quantify toxic dinoflagellate Pfiesteria via light microscope due to various life stage and morphological similarity with Pfiesteria-like dinoflagellate (PLD) species. Alternatively, we developed quantitative real-time PCR (qPCR) assay based on EvaGreen against the internal transcribed spacer 1 ribosomal RNA gene region for the analysis of the geographical distribution and population dynamics in Korean coastal waters.
Primer`s specificity was confirmed by BLAST search and competitive PCR with other genomic DNA which has similar sequence with target species. DNA was extracted, and 10-fold serial dilution of the DNA extracts were used to construct the standard curve. A strong linear correlation between log cell number and Ct value with correlation coeffiecients (R2) of 0.998 for the qPCR assay. The melting temperature of standard curve was acquired at 88 ℃ into the informative one peak. Field survey was performed for two objects; i) the analysis of geogra...

참고자료

· 없음