Site Directed Mutagenesis를 이용한 갑상선과산화효소 “근위부 히스티딘” 탐색

서지정보

· 발행기관 : 대한내분비학회
· 수록지 정보 : Endocrinology and Metabolism / 18권 / 4호 / 371 ~ 378페이지
· 저자명 : 김원배, 송영기

초록

연구배경: 갑상선과산화효소(thyroperoxidase, TPO)는 헴(heme)을 함유하는 세포막에 발현되는 당단백으로, 갑상선 여포세포에서 갑상선호르몬 생성 과정의 가장 중요한 단계인 요오드의 유기화를 촉매 한다. TPO는 단일 펩티드로 이루어져 있으며 하나 이상의 이황화 결합으로 생성되는 고리를 갖고 있다. 이 단백질의 삼차원 구조의 유지는 효소 활성 및 면역원 기능을 나타내는데 필수적이다. “근위부 히스티딘”은 헴의 철 결합 중심부와 관련되어 있기 때문에 효소 활성 유지에 중요한 역할을 하는 아미노산 부위로 알려져 있다. TPO의 결정 구조는 아직 알려져 있지 않으나 골과산화효소(myeloperoxidase)와의 아미노산 염기서열을 비교한 바에 따르면 407번째 히스티딘이 “근위부 히스티딘”으로 작용할 것이라는 보고가 있었다.방법: TPO의 407번째 히스티딘이 “근위부 히스티딘”으로 작용하는지 알아보고자 이를 아르지닌으로 치환한 변이 유전자(H407R)와 바로 근처에 위치하는 414번째 히스티딘을 아르지닌으로 치환한 변이 유전자(H414R)를 site directed mutagenesis법으로 제조하였다. 변이 유전자(cDNA)를 COS-7 세포에 전달감염시켜 변이 단백질을 만들고 그 효소 활성을 guaiacol assay로 측정하였다. 또한, 근위부 히스티딘 주변부에 존재하는 시스테인기들을(375, 389, 598, 655번째 아미노산) 세린으로 치환한 변이 유전자를 만들어 같은 실험을 하여 분자내 이황화 결합 구조 형성에 관여하는지를 알아보았다.결과: H407R과 H414R을 전달 감염시킨 세포에서 변이 단백질이 발현됨을 하시모토 환자의 혈청에 존재하는 IgG를 일차항체로 이용한 Western blot으로 확인하였다. 두 가지 변이 단백질은 모두 야생형 TPO보다는 낮지만 유의한 peroxidase 활성을 나타내었다. 시스테인기를 치환한 네 종류(C375S, C389S, C598S, C655S)의 변이 유전자는 peroxidase 활성을 모두 소실하였으나, 하시모토 환자의 혈청에 존재하는 IgG를 일차항체로 이용한 Western blot으로 단백질 발현 자체도 발견할 수 없었다.

참고자료

· 없음