생명과학실험1 SDS-PAGE & Coomassie blue Staining

문서 내 토픽

• 1. SDS의 역할 및 원리

  SDS(sodium dodecyl sulfate)는 계면활성제의 일종으로 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만들어주는 역할을 한다. 아미노산의 소수성 부분과 hydrophobic interaction을 하며 결합하는데, 아미노산 2개당 1개 정도 binding하여 단백질을 변성한다.

• 2. Gel에 들어가는 시료의 역할

  ① Tris-HCl: Stacking gel과 Resolving gel의 pH를 다르게 하여 각 gel에서 Glycine의 charge 다르게 조정해준다. 또한 Cl-를 첨가해주어서 이후 전기영동에서 전기를 걸어줄 때 중요한 역할을 하게끔 해준다. ② SDS: 아미노산 2개에 하나씩 결합해 비공유 결합을 저해시켜 단백질을 변성시키며, 모든 단백질에 (-) masking을 걸어 전극을 걸었을 때 단백질들이 (+)를 향해 이동할 수 있게 한다. ③ APS: acrylamide의 교차연결을 촉매하며, 반응의 Initiator이다. 따라서 라디칼의 개시 물질이기 때문에 실험 사용시 만든다. ④ TEMED: APS의 중간체를 안정화시키는 Catalyst이다. free radical을 형성하게 함으로써 gel의 형성을 촉매한다.

• 3. Resolving, stacking gel의 차이

  Resolving gel과 Stacking gel는 pH가 다르고, 이에따라 다른 역할을 한다. 먼저 stacking gel은 시료가 같은 위치에서 전기영동을 시작할 수 있도록 한다. glycine 이온은 pl값이 6으로, pH가 6.8인 stacking gel에서 net charge가 0에 가깝다. mobility는 Cl이온, 단백질, glycine순서로 크다. 따라서 protein이 glycine과 Cl이온 사이에 갇혀있게끔 만든다. 이 과정을 통해 시료가 같은 위치에서 전기영동을 시작 할 수 있도록 한다. Resolving gel은 pH가 8.8이다. mobilitysms Cl이온 glycine, 단백질 순서로 크며 Cl이온과 gly사이에 있던 단백질들이 이동할 수 있게된다. 이 때 단백질의 이동은 자신의 분자량에 따라 영향을 받는다. (분자량이 크면 천천히 이동하고 분자량이 작으면 빠르게 이동한다. 따라서 resolving gel은 단백질이 고유의 size에 따라 이동할 수 있게끔 만드는 역할을 한다.

• 4. Coomassie blue

  Coomassie blue는 단백질의 염색색소이다. 단백질을 이루는 아미노산 잔기 중 일부와 공유결합을 하여 젤 내의 단백질 밴드를 푸른 색으로 염색한다. 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250은 폴리아크릴아미드 겔 등을 지지체로 한 각종, 전기영동후 단백질의 위치 검출에 사용하는데, 0.5μg이상 40μg까지인 단백질에는 정량적으로 작용한다. 단백질 밴드의 이동정도를 표준 분자량 마커와 비교하여 단백질의 분자량을 추산할 수 있다.

• 5. SDS-PAGE & Coomassie blue Staining 실험 과정

  1차시 SDS- Polyacrylamide gel 만들기: 유리판 안쪽에 에탄올을 뿌리고 깨끗이 닦는다. 두 유리판을 겹치고 holder에 고정시킨다. gel 용액을 만들어 resolving gel, stacking gel을 순서대로 부어 굳힌다. 2차시 SDS-PAGE & Coomassie blue Staining: 준비된 단백질 샘플을 가열하고 loading한다. 전기영동 후 staining solution으로 염색하고 destaining solution으로 배경을 제거한다. 결과 사진을 찍어 분석한다.

• 6. 실험 결과 분석

  정제 전보다 정제 후 AP의 순도(전체 단백질 밴드 중 AP band의 intensity 비율)가 높아졌다. NaCl 150일 때 가장 정제가 잘되어 AP의 순도가 가장 높았다. 정제 전의 PM band에 많은 종류의 band가 있었지만, 정제한 다른 부분에는 특정 부분에 band가 많이 형성된 것을 볼 수 있다. 이를 통해 특정 부분에 해당하는 단백질이 많이 남아 있다는 것을 알 수 있다.

• 7. 실험 과정의 어려움

  실험을 하면서 gel을 만드는 부분에 있어서 시행착오가 많았다. gel이 잘 굳지 않아서 여러 번 만들었고, 양이 부족하여 각 분획 사이의 벽이 높이 세워지지 않았다. 이로 인해 단백질 시료가 들어갈 수 있는 자리가 많이 없어서 시료를 적게 넣어야 했고, loading 중 시료가 섞일 수 있었다.

• 8. 정제 후 순도가 높아지지 않은 경우의 원인

  만약 정제 후 순도가 높아지지 않았다면, 다음과 같은 이유를 생각해 볼 수 있다: - loading된 sample의 양이 너무 많거나 적을 경우 - sample이 다른 well로 넘어가서 시료끼리 섞인 경우 - gel 제작 과정에서 문제가 있어 각 분획 사이의 벽이 높이 세워지지 않은 경우

• 9. 정제 과정에서 발견된 다른 단백질 밴드의 원인

  친화도 크로마토그래피로 분리하여 용출 된 sample를 loading하여 밴드를 관찰 하였을 때 모든 분획에서 관찰된 부분인 AP 단백질 이외에도 다른 Size의 단백질 밴드를 관찰 할 수 있다. 이는 친화도 크로마토그래피 과정에서 AP 이외에도 Cl이온과 상호작용을 하는 단백질이 존재함을 의미한다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. SDS의 역할 및 원리

  SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)는 단백질 전기영동 실험에서 매우 중요한 역할을 합니다. SDS는 단백질의 2차, 3차 구조를 파괴하여 단백질을 선형 구조로 만들어 주며, 음전하를 띠게 합니다. 이를 통해 단백질의 크기에 비례하여 이동속도가 결정되도록 합니다. 또한 SDS는 단백질과 결합하여 단백질 분자량에 비례한 음전하를 띠게 함으로써 전기영동 시 단백질이 크기에 따라 분리되도록 합니다. 이러한 SDS의 역할은 단백질의 순수한 분자량 정보를 얻을 수 있게 해줍니다.

• 2. Gel에 들어가는 시료의 역할

  Gel에 들어가는 시료는 단백질 전기영동 실험에서 매우 중요한 역할을 합니다. 시료에는 단백질 샘플, SDS, 환원제, 염료 등이 포함됩니다. 단백질 샘플은 분리하고자 하는 단백질이 포함된 용액입니다. SDS는 단백질의 2차, 3차 구조를 파괴하여 선형 구조로 만들어 줍니다. 환원제는 단백질의 이황화 결합을 끊어 완전히 선형 구조로 만들어 줍니다. 염료는 단백질 밴드를 가시화하기 위해 사용됩니다. 이러한 시료 성분들은 단백질이 크기에 따라 효과적으로 분리되도록 하는 데 필수적입니다.

• 3. Resolving, stacking gel의 차이

  Resolving gel과 stacking gel은 SDS-PAGE 실험에서 중요한 역할을 합니다. Resolving gel은 단백질을 크기에 따라 분리하는 역할을 하며, 보통 8-15%의 acrylamide 농도로 구성됩니다. 이 gel에서 단백질은 크기에 따라 분리됩니다. Stacking gel은 시료를 농축하여 단백질 밴드를 sharp하게 만드는 역할을 합니다. 보통 4-5%의 낮은 acrylamide 농도로 구성되며, 시료가 이 gel을 통과하면서 단백질이 농축됩니다. 이를 통해 단백질 밴드의 분리능이 향상됩니다.

• 4. Coomassie blue

  Coomassie blue는 단백질 전기영동 실험에서 단백질 밴드를 가시화하는 데 사용되는 염료입니다. Coomassie blue는 단백질과 결합하여 푸른색을 나타내므로, 단백질 밴드가 푸른색으로 나타나게 됩니다. Coomassie blue는 비교적 민감도가 높아 nanogram 수준의 단백질도 검출할 수 있습니다. 또한 Coomassie blue 염색은 가역적이므로, 단백질을 추출하여 다른 실험에 사용할 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 Coomassie blue는 단백질 전기영동 실험에서 널리 사용되고 있습니다.

• 5. SDS-PAGE & Coomassie blue Staining 실험 과정

  SDS-PAGE와 Coomassie blue 염색 실험은 다음과 같은 과정으로 진행됩니다. 1) 시료 준비: 단백질 샘플에 SDS, 환원제, 염료 등을 섞어 준비한다. 2) 전기영동: 준비된 시료를 resolving gel과 stacking gel에 loading하고 전기영동을 수행한다. 3) Coomassie blue 염색: 전기영동이 끝난 gel을 Coomassie blue 용액에 담가 단백질 밴드를 염색한다. 4) 탈색: 과도한 염료를 제거하기 위해 탈색 용액으로 처리한다. 5) 결과 분석: 염색된 단백질 밴드를 관찰하고 분자량을 추정한다. 이 과정을 통해 복잡한 단백질 샘플의 구성을 확인할 수 있습니다.

• 6. 실험 결과 분석

  SDS-PAGE와 Coomassie blue 염색 실험의 결과 분석은 다음과 같이 이루어집니다. 먼저, 단백질 밴드의 위치와 강도를 관찰하여 단백질 샘플의 구성을 확인합니다. 밴드의 위치는 단백질의 분자량에 비례하므로, 표준 단백질 마커와 비교하여 각 밴드의 분자량을 추정할 수 있습니다. 밴드의 강도는 단백질의 상대적인 양을 나타냅니다. 이를 통해 단백질 샘플의 복잡성, 주요 구성 성분, 정제 과정의 효율성 등을 평가할 수 있습니다. 또한 예상치 못한 밴드가 관찰되는 경우 추가적인 분석이 필요할 수 있습니다.

• 7. 실험 과정의 어려움

  SDS-PAGE와 Coomassie blue 염색 실험에서 겪을 수 있는 어려움은 다음과 같습니다. 1) 시료 준비: 단백질 샘플의 농도, SDS와 환원제의 농도, 염료 첨가 등 시료 준비 과정에서 최적화가 필요합니다. 2) 전기영동: 전압, 전류, 시간 등 전기영동 조건을 적절히 설정해야 합니다. 3) 염색 및 탈색: Coomassie blue 염색 시간, 탈색 용액 농도 및 시간 등을 조절해야 합니다. 4) 결과 해석: 예상치 못한 밴드 패턴, 밴드 강도의 차이 등을 해석하기 어려울 수 있습니다. 이러한 어려움을 극복하기 위해서는 실험 조건의 최적화와 경험이 필요합니다.

• 8. 정제 후 순도가 높아지지 않은 경우의 원인

  단백질 정제 후에도 순도가 높아지지 않은 경우, 다음과 같은 원인을 고려해볼 수 있습니다. 1) 정제 방법의 한계: 사용한 정제 기법이 목표 단백질을 충분히 분리하지 못했을 수 있습니다. 2) 단백질 변성: 정제 과정에서 단백질이 변성되어 활성을 잃었을 수 있습니다. 3) 단백질 응집: 단백질이 응집되어 정제 수율이 낮아졌을 수 있습니다. 4) 오염 물질의 지속적 존재: 정제 과정에서 완전히 제거되지 않은 오염 물질이 남아있을 수 있습니다. 5) 단백질 분해: 단백질 분해 효소에 의해 목표 단백질이 분해되었을 수 있습니다. 이러한 원인을 파악하고 개선하는 것이 정제 효율을 높이는 데 중요합니다.

• 9. 정제 과정에서 발견된 다른 단백질 밴드의 원인

  정제 과정에서 예상치 못한 단백질 밴드가 발견되는 경우, 다음과 같은 원인을 고려해볼 수 있습니다. 1) 목표 단백질의 분해: 단백질 분해 효소에 의해 목표 단백질이 부분적으로 분해되어 다른 밴드로 나타났을 수 있습니다. 2) 목표 단백질의 변성: 정제 과정에서 단백질이 변성되어 예상과 다른 이동 속도를 보였을 수 있습니다. 3) 오염 단백질의 존재: 정제 과정에서 완전히 제거되지 않은 오염 단백질이 남아있을 수 있습니다. 4) 단백질 복합체 형성: 목표 단백질이 다른 단백질과 복합체를 형성하여 예상과 다른 밴드로 나타났을 수 있습니다. 이러한 원인을 파악하고 개선하는 것이 정제 과정의 효율성을 높이는 데 중요합니다.