NO assay

문서 내 토픽

1. NO assay

이번 실험은 NO assay를 수행하여 항염효과를 알고자 하는 extract A와 염증반응을 유발하는 LPS를 처리하고 염증정도를 비교했다. RAW 264.7에서 염증반응으로 생성된 NO₂는 griess reagent와 반응하여 분홍색의 azo product가 생성되는데 최대흡광파장인 540nm에서 흡광도를 측정하면 간접적으로 NO 생성량을 측정하고 염증 정도를 알 수 있다. Standard solution을 제조하여 standard curve를 그린 결과 y=0.0349x+0.0834 (R² = 0.9995) 검량선을 얻었으며 R²이 0.999 이상이므로 신뢰도가 높은 결과라고 볼 수 있다. Sample의 흡광도 값을 검량선에 대입하여 NO production을 구한 결과 LPS 처리군은 NO 생성량이 가장 높게 나타난 것을 보아 LPS에 의한 염증이 유발되었던 것을 확인했다. LPS와 extract A를 처리한 군은 LPS처리군에 비해 NO 생성량이 낮고 control과 유사한 수준의 NO 생성량을 보였으므로 extract A의 항염증 효과가 있음을 알 수 있다.
2. LPS 처리에 따른 RAW264.7 세포의 형태 변화

LPS는 그람음성세균의 외막 성분이며, 대식세포인 RAW264.7를 활성화시켜 염증반응을 유도하고 다음과 같은 morphology 변화를 유도한다. LPS 자극 후에는 lamellipodia 및 filopodia가 돌출되면서 동그란 모양이었던 세포가 납작하게 퍼지는 모양으로 변화하는 cell spreading이 나타나고 세포 접착과 이동을 돕는다. Lamellipodia는 액틴 필라멘트를 포함하는 세포 가장자리 구조이며 filopodia는 액틴을 포함하는 스파이크이다. 세포막의 변화로는 세포 표면에 주름을 형성하는 membrane ruffling이 일어나고 필라멘트 구조 형성이 유도되어 세포 이동과 식세포 작용을 돕는다. 세포질의 변화로는 세포소기관의 위치 조정과 액포 형성, 리소좀 축적이 일어난다. 이와 같은 morphology 변화는 병원체 감지와 탐식 능력을 촉진하고 다른 면역 세포와 소통하게 만든다.
3. NO assay에서 상층액 사용의 이점

NO는 매우 반응성이 높은 분자이므로 세포내 구성요소와 활발히 반응할 수 있다. 상층액을 사용하면 세포 내 반응에 의한 간섭 없이 염증반응으로 생성되어 방출된 NO를 더 정확하게 측정할 수 있다. 또한, 상층액 세포를 분리하면서 세포 내 NOS에 의해 생성된 NO를 배제하고 염증반응에 의해 세포 외로 방출된 NO만을 선별하여 측정할 수 있다.
4. Griess reagent의 빛 민감성

Griess reagent와 같은 형광성 물질은 빛에 차단된 상태로 보관해야 하는데 시약이 빛에 민감하기 때문이다. Griess reagent가 빛에 노출되면 광화학적 반응이 진행되어 위양성 데이터가 나오거나 background noise를 증가시켜서 nitrite 농도 측정 결과가 부정확해질 수 있다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

1. NO assay

NO assay는 세포 내 nitric oxide (NO) 생성을 측정하는 중요한 실험 기법입니다. NO는 다양한 생리학적 과정에 관여하며, 염증 반응, 혈관 확장, 신경 전달 등에 중요한 역할을 합니다. NO assay를 통해 세포의 NO 생성 능력을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이를 통해 약물 처리, 유전자 조작 등이 NO 생성에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다. 또한 질병 모델 연구에서 NO 생성 변화를 관찰함으로써 병리학적 기전을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 NO assay는 세포 생물학, 약리학, 면역학 등 다양한 분야에서 널리 활용되는 중요한 실험 기법이라고 할 수 있습니다.
2. LPS 처리에 따른 RAW264.7 세포의 형태 변화

RAW264.7 세포는 대식세포 계열의 세포주로, 면역 반응 연구에 널리 사용됩니다. LPS (lipopolysaccharide)는 그람 음성 세균의 세포벽 성분으로, RAW264.7 세포에 처리하면 염증 반응을 유발합니다. LPS 처리에 따른 RAW264.7 세포의 형태 변화를 관찰하는 것은 이러한 면역 반응 기전을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 LPS 처리 후 RAW264.7 세포는 크기가 증가하고 세포질 내 과립이 증가하며, 세포 표면의 돌기가 늘어나는 등 활성화된 대식세포의 특징을 보입니다. 이러한 형태적 변화는 세포의 기능적 변화, 즉 식균 능력 증가, 사이토카인 분비 증가 등과 연관되어 있습니다. 따라서 LPS 처리에 따른 RAW264.7 세포의 형태 변화를 관찰하는 것은 면역 반응 연구에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.
3. NO assay에서 상층액 사용의 이점

NO assay에서 상층액을 사용하는 것은 다음과 같은 이점이 있습니다. 첫째, 세포 내에 존재하는 NO를 직접 측정하는 것보다 상층액 내 NO 농도를 측정하는 것이 더 간단하고 효율적입니다. 세포 내 NO는 매우 불안정하고 반응성이 높아 측정이 어려울 수 있지만, 상층액 내 NO는 상대적으로 안정적이므로 측정이 용이합니다. 둘째, 상층액 내 NO 농도는 세포의 NO 생성 능력을 간접적으로 반영합니다. 따라서 상층액 NO 측정을 통해 세포의 기능적 상태를 평가할 수 있습니다. 셋째, 상층액 사용 시 세포를 파괴하지 않고도 NO 생성을 측정할 수 있어 동일한 세포 집단에서 반복 실험이 가능합니다. 이를 통해 실험의 재현성을 높일 수 있습니다. 따라서 NO assay에서 상층액을 사용하는 것은 실험의 편의성, 효율성, 재현성 등을 높일 수 있는 장점이 있습니다.
4. Griess reagent의 빛 민감성

Griess reagent는 NO assay에서 널리 사용되는 시약으로, 질산염(nitrite)과 반응하여 색 변화를 일으킵니다. 이를 통해 세포 배양액 내 질산염 농도를 측정할 수 있고, 이는 간접적으로 NO 생성을 반영합니다. 그러나 Griess reagent는 빛에 민감한 특성이 있습니다. 빛에 노출되면 자체적으로 색 변화가 일어나 측정값에 오차를 초래할 수 있습니다. 따라서 Griess reagent를 사용할 때는 빛 노출을 최소화하는 것이 중요합니다. 실험 과정에서 Griess reagent 사용 시 차광 처리된 용기를 사용하거나, 실험실 내 조명을 최소화하는 등의 주의가 필요합니다. 또한 표준 곡선 작성 시에도 빛 노출을 동일하게 유지해야 합니다. 이러한 빛 민감성을 고려하여 Griess reagent를 적절히 다룸으로써 NO assay의 정확성과 재현성을 높일 수 있습니다.

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