PCR을 통한 gene structure 분석

문서 내 토픽

1. EtOH Precipitation

DNA는 전하를 띄는 인산골격을 가지고 있어서 극성이다. 물도 극성이므로 물에 잘 녹는다. DNA를 뭉치게 하려면 물과 DNA간 결합을 약화시켜야 한다. Ethanol은 물보다 훨씬 덜 극성이다. 따라서 ethanol을 첨가하면 DNA의 인산기와 다른 양이온간의 결합이 강해지면서 DNA 침전을 형성한다. 이 과정을 위해선 적절한 양의 양이온이 필요하다. 너무 많으면 DNA와 같이 침전되고 너무 적으면 침전되지 못한 DNA가 생긴다. 이 실험에선 3M sodium acetate를 final 0.3M이 되도록 넣었다. 그리고 보통 2,3배 양의 95% 이상의 ethanol을 첨가한다. DNA를 -70도에서 15분이상보관한다. DNA의 길이가 짧고 농도가 낮을수록 시간을 길게 둔다 . 다음으로 CNFG (13000rm, 10min)시켜준다. CNFG의 시간과 속도가 DNA 회수율에 가장 큰 영향을 끼친다. 크기가 작고 농도가 낮을수록 더 빠르고 오랜 시간동안 원심분리시킨다. 만약 온도가 낮으면 용액의 점도가 높아지고 용액의 양이 많으면 DNA가 이동해야할 거리가 늘어나므로 더 긴 시간의 CNFG가 필요하다.
2. PCR의 종류와 유전자 분석에 이용되는 경우

PCR은 특정한 DNA 샘플을 매우 많이 복제할 때 사용하는 기술이다. Quantitative PCR (qPCR, real time PCR)은 증폭되는 DNA양을 실시간으로 알 수 있는 방법이다 .일반 PCR에 형광용액을 첨가해서 형광광도계를 이용해 DNA농도를 분석한다. 대조군을 위해 D농도를 단계적으로 희석한 DNA를 PCR한다. 결과를 비교해서 시료의 DNA양을 알 수 있다. QPCR은 SNPs분석에 이용된다. SNPs(Single Nucleotide polymorphisms)는 염기 하나가 점돌연변이되어 사람마다 다르게 나타나는 특정 부위이다. 돌연변이이므로 유전자 부위에 따라 질병을 유발할 수 있다. SNP가 질병유전자와 가까이 생기면 같이 유전되므로 병을 조사할 때 이용되기도 한다. SNP와 같은 genetic maker로 RFLP, SSLP 등이 있다. RFLP는 제한효소 자리에 돌연변이가 생겨 제한효소 처리시 생성되는 DNA절편의 길이나 개수가 다른 현상이다. SSLP는 감수분열시 상동염색체 교차에 의해 짧은 반복서열의 반복수가 다른 현상이다. Reverse Transcript PCR (RT-PCR)은 mRNA를 cDNA로 역전사한 뒤 PCR로 증폭시키는 방법이다. RNA는 잘 분해되기 때문에 cDNA로 만들면 안정적인 실험이 가능하다. 아주 적은 양의 RNA도 증폭 가능한 장점이 있다. RT-PCR은 microarray분석에 이용된다. Microarray는 세포에서 RT PCR로 얻어낸 cDNA와 형광염료가 부착된 상보적인 DNA와 혼성화시켜 세포에서 그 유전자의 발현이 일어나는지 확인하는 방법이다.

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1. EtOH Precipitation

EtOH (Ethanol) precipitation is a widely used technique in molecular biology and biochemistry for the purification and concentration of nucleic acids, such as DNA and RNA. This method takes advantage of the fact that nucleic acids are insoluble in high concentrations of ethanol, while contaminants such as salts, proteins, and small molecules remain soluble. The process involves adding a high concentration of ethanol to a solution containing the nucleic acids, which causes the nucleic acids to precipitate out of the solution. The precipitated nucleic acids can then be collected by centrifugation and washed to remove any remaining contaminants. This technique is particularly useful for purifying DNA or RNA from complex biological samples, such as cell lysates or tissue extracts, and is often used as a preparatory step before further analysis or manipulation of the nucleic acids. One of the key advantages of EtOH precipitation is its simplicity and cost-effectiveness, making it a widely adopted method in many laboratories. Additionally, the technique can be easily scaled up or down to accommodate different sample sizes and can be used to purify a wide range of nucleic acid types, including plasmid DNA, genomic DNA, and various forms of RNA. However, it is important to optimize the protocol, such as the ethanol concentration and incubation time, to ensure efficient and selective precipitation of the desired nucleic acids.
2. PCR의 종류와 유전자 분석에 이용되는 경우

PCR (Polymerase Chain Reaction) is a powerful molecular biology technique that allows for the amplification of specific DNA sequences from a small amount of starting material. There are several different types of PCR, each with its own unique applications and characteristics: 1. Conventional PCR: This is the most basic form of PCR, where a target DNA sequence is amplified using a pair of specific primers and a thermostable DNA polymerase. Conventional PCR is widely used for a variety of applications, such as gene expression analysis, genotyping, and diagnostic testing. 2. Real-Time PCR (qPCR): This method allows for the quantification of the target DNA sequence during the amplification process. Real-time PCR is commonly used for gene expression analysis, viral load quantification, and detection of genetic mutations or polymorphisms. 3. Reverse Transcription PCR (RT-PCR): This technique is used to amplify RNA sequences by first converting the RNA into complementary DNA (cDNA) using a reverse transcriptase enzyme, and then performing a standard PCR amplification. RT-PCR is widely used for the analysis of gene expression, detection of RNA viruses, and characterization of transcriptomes. 4. Multiplex PCR: This method allows for the simultaneous amplification of multiple target DNA sequences in a single reaction. Multiplex PCR is often used for applications such as pathogen detection, forensic analysis, and genetic profiling. PCR is extensively used in various fields of genetic analysis and research, including: - Gene expression analysis: PCR is used to quantify the expression levels of specific genes in different tissues or cell types. - Genetic diagnosis and screening: PCR-based techniques are employed for the detection of genetic disorders, inherited diseases, and infectious agents. - Forensic DNA analysis: PCR is a crucial tool in forensic science for DNA profiling, identification, and paternity testing. - Evolutionary and phylogenetic studies: PCR is used to amplify and analyze DNA sequences for the purpose of understanding evolutionary relationships and phylogenetic relationships between organisms. - Molecular cloning and genetic engineering: PCR is an essential technique for the amplification and manipulation of DNA sequences for various biotechnological applications.

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