본문내용
1. 선택배지와 그람염색
1.1. 미생물 배양의 목적과 필요성
미생물 배양의 목적과 필요성은 다음과 같다.
미생물 배양의 주된 목적은 자연환경에 존재하는 다양한 미생물들을 실험실 환경에서 증식시켜 순수 분리된 균주를 확보하는 것이다. 이를 통해 미생물의 생리적 특성, 병원성, 유전형질 등을 심도 있게 연구할 수 있다. 또한 배양을 통해 의약품, 발효식품, 산업용 효소 등의 생산에 활용되는 유용 미생물을 확보할 수 있다.
미생물 배양의 필요성은 다음과 같다. 첫째, 자연계에 존재하는 미생물은 대부분 배양이 어려운 호기성 종속영양세균이기 때문에 이들을 배양하여 순수 분리하고 특성을 밝히는 것이 중요하다. 둘째, 병원성 미생물의 경우 감염 메커니즘과 병인성을 규명하기 위해 배양을 통한 실험적 접근이 필수적이다. 셋째, 식품미생물학적 관점에서 식중독균, 부패미생물 등의 배양은 식품의 품질관리와 위생안전성 확보에 활용된다. 넷째, 유용 미생물의 대량 배양은 다양한 산업 분야에서 활용도가 높다.
따라서 미생물 배양은 미생물 연구와 산업 응용 측면에서 매우 중요한 기술이라 할 수 있다.
1.2. 선택배지의 원리와 종류
1.2.1. MacConkey 한천배지
MacConkey 한천배지는 그람음성 세균의 선택배지이자 유당 발효능 차이에 따른 감별배지로 사용된다. 이 배지에는 담즙산염(bile salts)과 유당이 포함되어 있다. 담즙산염은 그람양성 세균의 발육을 억제하는 역할을 하며, 유당 발효능에 따라 세균의 집락 색상이 달라진다.
유당을 발효하는 그람음성 세균(대장균 등)은 분홍색 집락을 형성하지만, 유당을 발효하지 않는 그람음성 세균(살모넬라, 프로테우스 등)은 무색 집락을 형성한다. 또한 프로테우스균과 같이 유주현상을 보이는 세균은 한천의 농도를 높이거나 NaCl 농도를 낮추어 배지를 제조하면 이를 억제할 수 있다. 대장균 O157:H7과 같은 출혈성 대장균은 sorbitol을 발효하지 못하므로 lactose 대신 sorbitol이 첨가된 MacConkey 배지를 사용하여 선별할 수 있다"
즉, MacConkey 한천배지는 그람음성 병원성 세균을 선별적으로 분리하고 유당 발효능에 따라 세균을 감별하는데 유용한 배지라고 할 수 있다.
1.2.2. Salmonella-Shigella (SS) 배지
SS (Salmonella-Shigella) 배지는 병원성 장내세균, 특히 Salmonella 균주를 분리하는데 사용되는 선택감별배지이다. 이 배지는 Shigella의 일차적인 분리 목적으로는 권장되지 않는다.
배지 내의 bile salt와 brilliant green은 그람양성균의 발육을 억제하는 역할을 한다. 또한 유당과 neutral red가 기질과 지시제로 들어있으며, sodium thiosulfate와 ferric citrate가 H2S 생성을 확인할 수 있는 지시제로 첨가되어 있다.
유당을 발효하는 E. coli, K. pneumoniae 등은 작은 분홍색 또는 적색 집락을 형성하지만, 유당을 발효하지 않는 Salmonella, Proteus, Shigella 균주 등은 무색 집락을 형성한다. 특히 H2S 생성 Salmonella 균주는 중앙이 검은 무색 집락을 보인다.
이처럼 SS 배지는 Salmonella 균의 선택적 분리와 동정에 효과적으로 활용될 수 있다. 병원성 장내세균을 분리하거나 연구하고자 할 때 SS 배지는 매우 유용한 선택배지라고 할 수 있다.
1.2.3. Bithmuth sulfate agar
Bithmuth sulfate agar는 Salmonella typhimurium, 다른 장내 세균과 분리를 위한 배지이다. 이 배지는 높은 영양분을 포함하고 있어 황화수소 생성 여부를 확인할 수 있으며, Salmonella를 제외한 많은 그람양성균과 그람음성균의 성장을 억제한다.
Bithmuth sulfate agar의 주요 특징은 다음과 같다. 첫째, 펩톤, 젤라틴, 유당, 철 암모늄 구연산, 비스무트 설페이트, 브릴리언트 그린과 같은 성분이 포함되어 있다. 둘째, 황화수소 생성 균주인 Salmonella는 배지에서 검은색 집락을 형성하는데, 이는 황화수소가 철 암모늄 구연산과 반응하여 생성된 결과이다. 셋째, 비스무트 설페이트와 브릴리언트 그린은 그람양성균과 일부 그람음성균의 성장을 억제하는 역할을 한다. 넷째, 유당 분해능이 떨어지는 Salmonella는 무색 집락을 형성하게 된다.
따라서 Bithmuth sulfate agar는 Salmonella 균주를 선별하고 분리하는데 효과적으로 활용될 수 있다. 이 배지를 통해 Salmonella의 특징적인 검은색 집락 형성을 확인함으로써 신속하고 정확한 동정이 가능하다. 또한 다른 장내 세균의 성장을 억제하여 Salmonella 분리를 용이하게 한다는 점에서 진단 및 연구 분야에서 중요한 역할을 한다고 볼 수 있다.
1.2.4. Baird parker medium
Baird parker medium은 Staphylococcus aureus의 선택배지로, S. aureus의 성장을 촉진하고 다른 세균들의 성장을 억제한다. 이 배지에서 S. aureus는 불투명한 검은색 또는 회색 집락을 형성하며, 집락 주변에 투명한 구역이 관찰된다. 이는 S. aureus가 가지고 있는 lecithinase 활성 때문이다.
반면 다른 세균들은 이 배지에서 자라기 어려워 집락을 형성하지 못하거나, 자라더라도 검은색이 아닌 흰색이나 갈색의 집락을 형성한다. 따라서 이 배지는 S. aureus를 선별적으로 분리, 동정하는데 사용된다.
Baird parker medium은 peptone, meat extract, lithium chloride, glycine, pyruvate, egg yolk tellurite 등의 성분으로 구성되어 있다. 이 중 egg yolk tellurite는 S. aureus의 lecithinase 활성을 확인할 수 있게 하는 지표물질이다. 또한 lithium chloride와 glycine은 다른 균의 성장을 억제하는 역할을 한다.
이와 같이 Baird parker medium은 S. aureus의 선택적인 분리와 동정에 널리 사용되는 유용한 배지이다."
1.2.5. Blood agar base
blood agar base는 영양강화배지이면서 용혈성을 구분하는 감별배지이다. 혈액한천평판배지는 포유류의 혈액을 약 5~10%정도 포함하고 있다. 이 배지는 까다로운 미생물을 동정하고 용혈반응을 검사하기 위해 사용된다. 베타 용혈은 집락 주변의 적혈구가 완벽히 용혈되고 소화되는 것을 보여준다. 베타 용혈의 대표적인 예는 Streptococcus haemolyticus이다. 알파 용혈은 헤모글로빈의 일부가 용혈되어 녹색을 보이는데, 알파 용혈의 예는 Streptococcus viridans이다. 감마 용혈은 용혈현상이 일어나지 않는 것을 말한다. 혈액한천배지를 이용하면 용혈 반응에 의해 해당 균주를 감별할 수 있다. 또한 이 배지는 영양강화 기능이 있어 까다로운 미생물의 배양에도 사용된다. 따라서 blood agar base는 용혈성 반응 확인과 더불어 영양이 풍부한 배지로서 미생물 배양에 널리 사용되고 있다.
1.3. 그람염색의 원리와 종류
1.3.1. 그람양성세균과 그람음성세균의 차이
그람양성세균과 그람음성세균의 차이는 다음과 같다.
그람양성세균의 세포벽은 약 10-80nm 두께로 거의 균일한 두께를 가지며, 주요 성분이 펩티도글리칸과 테이코산이다. 반면 그람음성세균의 세포벽은 두 개의 층으로 이루어져 있으며, 내층은 얇은 펩티도글리칸 층이고 외층은 리포다당질-인지질 이중막으로 구성되어 있다. 따라서 그람양성세균은 알코올에 의해 염료-요오드 복합체가 세포 내부에 그대로 유지되어 보라색으로 관찰되지만, 그람음성세균은 알코올에 의해 외막이 손상되어 염료-요오드 복합체가 유출되어 대조염료인 사프라닌에 의해 붉게 염색된다. 이러한 차이로 인해 그람염색법을 통해 세균을 그람양성과 그람음성으로 구분할 수 있다.
1.3.2. 그람염색법의 실습
그람염색법의 실습은 다음과 같다.
먼저, sterile saline을 슬라이드 위에 한방울 떨어뜨리고 백금이로 콜로니의 일부를 따서 슬라이드 위에 옮긴다. 공기중 편평한 곳에서 이를 말린 후 불꽃에서 2-3번 스쳐 말린다. 그 다음 30초 동안 crystal violet을 뿌리고 약 30초간 염색한다. 이는 세포를 고정하는 역할을 한다. 이후 gram iodine액...
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