본문내용
1. 서론
1.1. Western Blot의 정의 및 특징
Western Blot은 생화학 및 분자생물학 분야에서 널리 사용되는 단백질 검출 방법이다. 이는 단백질의 전위적 특성을 이용하여 단백질을 분리하고, 특정 단백질에 대한 항체를 이용해 해당 단백질을 검출하는 기법이다."
Western Blot의 주요한 특징은 다음과 같다. 첫째, 단백질 혼합물에서 특정 단백질을 선택적으로 검출할 수 있다. 이를 위해 항원-항체 반응의 특이성을 이용한다. 즉, 1차 항체는 목표 단백질에 특이적으로 결합하고, 2차 항체는 1차 항체에 특이적으로 결합하여 신호를 발생시킨다. 이를 통해 복잡한 단백질 혼합물에서도 특정 단백질을 선별적으로 검출할 수 있다."
둘째, 단백질의 크기와 양을 확인할 수 있다. 단백질을 SDS-PAGE를 통해 크기별로 분리한 뒤, 항체를 이용해 특정 단백질을 검출하면 단백질의 크기와 상대적인 양을 알 수 있다."
셋째, 단백질의 여러 가지 형태를 구분할 수 있다. 단백질의 포스포릴레이션, 당쇄화 등 다양한 번역 후 변형을 확인할 수 있다. 이를 위해 특이적인 항체를 사용한다."
따라서 Western Blot은 복잡한 단백질 혼합물에서 특정 단백질의 존재, 크기, 양, 그리고 다양한 형태를 선택적으로 검출할 수 있는 강력한 분석 기법이라고 볼 수 있다.
1.2. 실험 목적
실험의 목적은 인간의 암세포에 물질 M을 처리했을 때 나타나는 단백질 발현을 비교하기 위해 진행되었다. 이를 위해 Western blot 분석법을 이용하여 암세포 조직에서 얻어낸 단일 암세포의 세포 내 단백질을 추출하고, 용액 A와 B가 해당 세포에 각각 어떠한 작용을 가지는지 파악하고자 하였다. 이 과정에서 인산화 된 Akt인 p-Akt와 인산화 과정이 이루어지지 않은 Akt의 발현 정도를 비교 관찰하였다.
2. 실험 방법
2.1. 시약 및 기구
실험에 사용한 시약 및 기구는 다음과 같다.
우선 단백질 추출 및 정량을 위한 시약으로 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), LIPA(Lysis buffer), Bradford assay kit 등이 사용되었다. DPBS는 세포 배양 시 세포를 세척하는 데 사용되는 인산염 완충 용액이며, LIPA buffer는 단백질을 추출하기 위해 세포막을 용해시키는 데 사용된다. Bradford assay kit는 단백질 정량을 위해 사용된다.
SDS-PAGE 전기영동을 위해서는 acrylamide gel, electrophoresis buffer, sample buffer, protein marker 등이 사용되었다. Acrylamide gel은 SDS-PAGE 과정에서 단백질을 크기별로 분리하는 데 사용되며, electrophoresis buffer와 sample buffer는 단백질의 전하와 구조를 유지하며 전기영동을 가능하게 한다. Protein marker는 단백질의 분자량을 확인하는 데 사용된다.
Membrane 전이 및 blocking을 위해서는 PVDF membrane, transfer buffer, blocking buff...
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