본문내용
1. 미생물 분리 및 동정
1.1. 실험 목적
이 실험의 목적은 균을 장기간 보관할 수 있는 stock solution와 균을 배양학 위한 LB agar 배지를 직접 제작해보고, 이 과정에서 마이크로피펫을 포함한 다양한 실험 기구들의 사용방법을 익히는 것이다. 또한 PCR과 겔 전기영동의 원리를 이해하고 이를 활용해 배양한 균의 염기서열을 직접 산출해낸다. 산출된 염기서열을 sequencing과정을 통해 미생물의 종을 확인해보며 Hydrolysis test, 그람염색법 그리고 Oxidase, catalase test을 이용해 실험으로 확인할 수 있는 균들의 특징을 확인해 보는 것까지가 이번 실험의 목표이다.
1.2. 실험 이론 및 원리
1.2.1. 미생물(Microorganium)
미생물은 육안으로 관찰할 수 없는 작은 생물을 일컫는 말이다. 미생물은 우리가 살고 있는 지구상에 압도적으로 많은 수를 자랑한다. 즉 거의 대부분의 장소와 물건에서 미생물이 존재한다고 할 수 있다.
미생물의 종류로는 원핵세포, 진핵세포, 바이러스로 분류된다. 원핵세포는 진핵세포에 비해 단순한 구조를 가지고 있으며, 형태가 매우 원시적이다. 또한 핵과 세포기관이 없으며, 유전물질이 핵막에 둘러싸여 있지 않고 세포질의 핵양체가 위치해 있다. 원핵세포에는 진정세균, 고세균 등이 대표적이다. 진핵세포는 복잡한 구조를 가진 진화된 세포로, 뚜렷한 핵막과 세포기관을 가지고 있다. 우리가 알고 있는 모든 동식물의 세포들은 전부 진핵세포로 분류되며 그 외에도 원생동물, 진균 그리고 조류도 모두 진핵세포로 분류되어 있다. 바이러스는 위의 두 종류의 미생물들과는 달리, 세포가 아니며, 세포벽도 존재하지 않는다. 바이러스는 자신만의 독자적인 분류체계를 가지며 유전물질(DNA)과 단백질 껍질만으로 이루어져 있다.
1.2.2. 획선평판법
획선평판법은 미생물 배양 시 single colony를 얻기 위한 방법 중 하나이다. 고체 배지에 반복하여 가는 선을 그어 접종하면 세균이 차례로 떨어져 나와 colony를 형성하게 된다.
이 방법은 균을 얇고 고르게 도말하여 관찰하기 편리한 배지를 만들 수 있다는 장점이 있다. 또한 단일 집락을 분리할 수 있어 순수 배양에 유리하다. 단일 집락을 선별할 수 있기 때문에 형태나 색깔, 크기 등의 특성을 관찰하기에도 용이하다.
이에 세균 동정을 위한 초기 배양 단계에서 널리 사용되는 방법이다. 배지에 균을 도말한 후 배양하면 각 균주가 개별적인 colony를 형성하여 관찰할 수 있으므로, 이를 통해 순수 배양체를 분리할 수 있다. 이후 선별된 단일 colony를 다른 배지에 계대 배양하면 해당 균주를 지속적으로 확보할 수 있다.
따라서 균배양 및 분리에 있어서 획선평판법은 필수적인 미생물학 실험 기법이라고 할 수 있다.
1.2.3. PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응)
PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응)은 DNA의 원하는 부분을 복제하고 증폭시키는 분자생물학적 기술이다. DNA sequence에서 특정 부분을 증폭시켜 미량의 DNA 양을 충분한 양으로 증폭시킴으로써 이후 동정 과정을 용이하게 해준다.
PCR에는 세 가지 단계가 있다. 첫째, DNA 변성 단계에서는 DNA 이중나선 구조를 열에 의해 분리시킨다. 둘째, Primer의 Annealing(결합) 단계에서는 분리된 단일가닥 DNA 에 상보적인 primer가 결합한다. 이때 프라이머의 결합 온도는 매우 중요한데, 온도가 너무 높으면 프라이머가 DNA와 약하게 결합하여 증폭된 DNA 양이 적고, 온도가 너무 낮으면 비특이적으로 결합하여 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있다. 셋째, 신장반응(Extension) 단계에서는 열에 강한 DNA 중합효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 합성한다. 이 과정을 반복하여 DNA의 원하는 부분을 증폭시킨다.
PCR로 증폭된 DNA 산물은 겔 전기영동을 통해 크기별로 분리되어 확인할 수 있다. 전기영동 결과 DNA 분자량 표준물질(ladder)과 비교하여 원하는 크기의 DNA 밴드가 생성되었는지 확인할 수 있다. 증폭된 DNA는 BLAST 분석 등을 통해 미생물의 종을 동정할 수 있다.
이처럼 PCR 기술은 미량의 DNA 시료로도 원하는 유전자 부위를 증폭시켜 분석할 수 있게 해줌으로써 미생물 동정에 널리 활용되고 있다.
1.2.4. 겔 전기영동
겔 전기영동은 DNA나 단백질과 같은 거대분자를 크기에 따라 분리하거나 순수하게 분리하는 기술이다. DNA는 인산기에 의해 전기영동에 사용되는 buffer 속에서 음전하를 띄고 있으며 전기장에 놓이게 되면 양의 전극 쪽으로 서로 다른 속도로 이동한다. DNA 분자의 이동속도는 분자량이 작을수록 빨라지고 겔의 밀도가 낮을수록 빨라진다. 또한 전류가 약할수록 빨라지며, DNA의 분자량이 같더라도 형태에 따라 움직이는 속도가 다르다. 겔 전기영동의 결과로는 띠를 형성하게 되는데, 이 띠는 복제된 DNA 중에 같은 길이를 가진 DNA 분자 그룹에 모여있다는 뜻이다.
겔 전기영동을 하는 이유는 결과적으로 DNA의 존재를 확인하기 위함이다. DNA 분자가 존재하지 않는다면 겔에서 형광으로 표지된 성분이 검출되지 않을 것이기 때문이다. 이 때 사용하는 완충액은 TAE Buffer로 DNA 운반에 필요한 이온을 공급하는 역할을 한다. TAE에서 T는 Tris로 양이온을 공급해 음전하를 띠는 DNA를 끌어주며, A는 Actetate로 Tris의 pH를 낮추기 위한 역할을 하며 마지막으로 E는 EDTA로 DNA 분해 방지를 위해 DNase의 활성에 필요한 마그네슘 이온 등의 2가 양이온을 4개의 Acetate기로 잡아준다. 양이온과 양전하를 잡아 전기영동에 필요한 음전하를 유지하는 것까지가 TAE Buffer의 역할이다.
이를 통해 알 수 있듯이 겔 전기영동은 DNA의 존재와 크기를 확인할 수 있는 중요한 실험 기술이며, 이를 통해 분리된 DNA 시료에 대한 후속 분석이 가능해진다. 특히 분자생물학 연구나 유전자 분석 등에서 필수적으로 사용되는 기법이라고 할 수 있다.
1.2.5. BLAST(Basic Local Alinment Search Tool)
BLAST(Basic Local Alinment Search Tool)는 단백질의 아미노산 배열 또는 DNA의 염기 서열을 비교하기 위한 연산법이다. BLAST 연산법은 감도보다는 속도를 중요시하기 때문에 유전체의 팽대한 자료 중에서 실용수준으로 검색이 가능하는 것으로 되어있다. 즉, DNA 염기 서열을 프로그램에 입력하였을 때 프로그램에 저장되어 있는 상당한 양의 염기 서열들과 비교 및 대조하여 가장 유사한 종을 찾아내는 연산법이자 프로그램이다. BLAST는 생물정보학 프로그램 중 가장 많이 이용되고 있는 것들 중 하나이다. BLAST와 비슷하지만 조금은 다른 Ez-Taxon이라는 프로그램도 존재한다고 한다.
BLAST는 전체 유전체 염기서열 데이터베이스와 입력한 DNA 염기서열을 비교하여 가장 유사한 서열을 찾아내는 도구이다. BLAST는 일반적으로 염기서열의 유사성을 검색하는 데 사용되며, 관심 있는 유전자나 단백질의 기능을 예측하거나 진화 관계를 추정할 때 매우 유용하게 활용된다.
BLAST는 DNA 서열 또는 단백질 서열을 데이터베이스와 비교하여 가장 유사한 서열을 찾아내고, 그 유사성의 정도를 통계적으로 평가한다. BLAST는 전체 데이터베이스를 대상으로 순차적으로 비교하는 것이 아니라, 효율적인 알고리즘을 통해 유사성이 높은 부분만을 골라내어 비교함으로써 매우 빠른 속도로 검색을 수행할 수 있다. 이러한 이유로 BLAST는 대용량 유전체 데이터베이스를 대상으로 하는 연구에서 널리 사용되고 있다.
BLAST의 주요 기능은 다음과 같다:
- 유전자 또는 단백질 서열과 데이터베이스의 모든 서열을 비교하여 유사도가 높은 서열들을 찾아내기
- 찾아낸 유사 서열들의 통계적 유의성을 평가하여 제시하기
- 유사 서열들의 상호 진화적 관계를 예측하기
- 새로 결정된 서열의 기능을 예측하기
이러한 BLAST의 기능은 다양한 생물정보학 분야에서 매우 유용하게 사용되고 있다. 예를 들어, 신규로 발견된 유전자의 기능을 추정할 때, 알려진 유사 유전자의 기능을 참고할 수 있다. 또한 진화적 관계를 추정할 때에도 BLAST를 이용하여 유사 서열을 찾고 이를 바탕으로 계통수를 작성할 수 있다.
BLAST는 다양한 종류의 BLAST 프로그램을 제공하고 있다. 대표적인 BLAST 프로그램에는 blastn(핵산 vs 핵산), blastp(단백질 vs 단백질), blastx(핵산 vs 단백질) 등이 있다. 각각의 BLAST 프로그램은 서로 다른 목적에 맞게 최적화되어 있다. 예를 들어, blastn은 핵산 서열 간 유사성 검색에 최적화되어 있고, blastp는 단백질 서열 간 유사성 검색에 최적화되어 있다.
BLAST는 생물정보학 분야에서 가장 많이 사용되는 도구 중 하나이다. 이는 BLAST가 제공하는 기능들이 다양한 생물학 연구에 매우 유용하기 때문이다. 특히 새로운 유전자나 단백질의 기능 추정, 진화 관계 분석 등의 분야에서 BLAST는 필수적인 도구로 활용되고 있다.
1.2.6. 그람 염색법 (Gram stain)
그람 염색법 (Gram stain)은 1884년 한스 크리스티안 그람이 고안한 특수 염색법으로 세균류를 염색하여 크게 두 종류로 나누는 방법이다. 그람 염색법에 의하면 대부분의 세균들은 두 종류로 분류되는데, 이는 세균들의 세포벽의 구조에 따라 결정된다.
그람 염색법을 진행할 때는 먼저 크리스탈 바이올렛으로 염색을 하고, 탈색 후 사프라닌으로 한번 더 염색을 진행한 후 세균의 색을 확인한다. 그람 염색법을 진행하였을 때, 세균이 보라색으로 염색된다면 그람 양성균이라 부르고, 보라색이 아닌 붉은색이 나오는 세균들은 그람 음성균이라 부른다.
그람 양성균은 세포벽이 두껍고 여러 층의 펩티도글리칸을 가지고 있어, 탈색을 진행하더라도 크리스탈 바이올렛의 색이 남아있게 된다. 반면, 그람 음성균은 세포벽이 얇고 한 층의 펩티도글리칸 구조를 가지고 있어, 첫 염색은 탈색에 의해 모두 색이 씻겨져 나가고 사프라닌에 의한 염색만이 남아있게 되어 붉은색으로 보이게 된다.
이처럼 그람 염색법은 세균의 세포벽 구조에 따라 그람 양성균과 그람 음성균으로 구분할 수 있는 기준을 제공하며, 이는 세균의 동정과 분류에 있어 중요한 역할을 한다.
1.3. 실험 기구 및 시약
1.3.1. 실험 기구
실험을 진행하기 위해 다양한 실험 기구들이 사용되었다. 먼저 약수저, 유산지(Weighing paper), 플라스크 or 유리병, 페트리접시, 전자저울, 메스실린더 등의 기본적인 실험기구들이 사용되었다. 또한 미생물 배양 및 실험을 위해 마이크로파이펫, tip, white loop, blue loop, 알코올 램프, 슬라이드 글라스, 커버글라스, 물받이 등의 기구들이 사용되었다. 이러한 실험 기구들은 미생물 배양, DNA 추출 및 증폭, 염기서열 분석 등 다양한 실험 과정에 사용되었다.""
1.3.2. 시약 및 용액
시약 및 용액은 다음과 같다.
1) LB media, Agar, 글리세롤, PCR premix(dNTP+Polymerase+Buffer)이다. LB media와 Agar는 배지 제작에 사용되며, 글리세롤은 배양된 미생물의 장기보관을 위해 사용된다. PCR premix에는 DNA 증폭에 필요한 dNTP, DNA 중합효소, 완충액 등이 포함되어 있다.
2) 10p...
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