본문내용
1. 서론
1.1. PCR과 전기영동의 개요
PCR(Polymerase Chain Reaction)은 DNA 중합효소를 이용하여 DNA의 양을 증폭시키는 기술이다. 특정 표적 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있다. PCR의 원리는 DNA가 온도 변화에 따라 변성된다는 점을 이용하며, pre-denaturation, 변성(denaturation), 결합(anealing), 신장(extension), post-extension, cooling의 단계로 구성된다. 이러한 1~6단계를 1 cycle이라 하며 이를 반복하여 2^n의 DNA가 증폭된다.
전기영동은 PCR 후 증폭된 DNA 조각을 분리하는 과정으로, 전하를 가지는 DNA 분자가 반대 전하를 가지는 전극을 향해 이동하는 성질을 이용한다. DNA의 인산기는 음전하를 띠고 있어 양극으로 끌려가며, 크기가 작은 DNA 조각일수록 빠르게 이동한다. 전기영동에 영향을 주는 요인으로는 DNA 분자의 크기, Agarose 농도, DNA 형태, 인가 전압, Buffer 농도 등이 있다.
1.2. PCR 기술의 원리와 활용
PCR은 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)의 약자로서 DNA 중합 효소를 이용하여 DNA의 양을 증폭시키는 기술이다. 검출을 원하는 특정 표적 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있다. PCR의 원리는 DNA가 온도 변화에 따라 변성된다는 점을 이용하는데, pre-denaturation, 변성(denaturation), 결합(annealing), 신장(extension), post-extension, cooling의 단계로 진행된다. 이렇게 1~6의 단계를 설정하고 2~4단계를 1 cycle이라 하며 이를 반복한다. cycle n회 반복 후 2^n의 DNA가 증폭된다.
PCR의 조성과 그 조성의 역할은 다음과 같다. Template DNA는 증폭시키고자 하는 특정 DNA부분을 가지고 있는 주형이며, F(forward), R(reverse) Primer는 DNA 특정 부분의 유전자를 증폭하기 위해 선정된다. Taq polymerase는 고온에서도 변성되지 않고 PCR반응을 일으키는 효소이다. dNTP는 DNA 합성에 필요한 재료이자 에너지를 제공한다. 10X buffer는 효소 최적 활성을 위한 환경을 제공하며 pH를 안정화한다. DW(증류수)는 DNA, dNTP, F, R primer가 합성될 수 있는 공간을 제공한다.
PCR 기술은 DNA 증폭을 통해 소량의 유전물질로부터 다량의 표적 DNA를 얻을 수 있어 유전자 분석, 유전자 클로닝, 질병 진단 등 다양한 분야에 활용된다. 특히 의료 분야에서 유전자 진단 키트 개발과 진단법 개선에 기여하고 있으며, 환경 분야에서는 토양이나 물의 미생물 분석에 활용되는 등 그 활용도가 매우 높다. 향후에도 PCR 기술은 지속적으로 발전하여 더 다양한 분야에 적용될 것으로 기대된다. []
1.3. 전기영동의 원리와 특성
전기영동은 DNA 분자의 크기, 형태, 전하 차이에 따라 분리되는 원리를 이용한다. DNA 분자는 인산기에 의해 음전하를 띠고 있으므로 음극에서 양극으로 이동하게 된다. DNA 분자의 크기가 클수록 다공성 사이를 통과하기 힘들어 느리게 이동하며, agarose 농도가 높을수록 다공성 그물구조가 촘촘해져 느리게 이동한다. 또한 DNA 분자의 형태에 따라 이동속도가 달라서 supercoiled DNA가 가장 빠르게, linear DNA, open circular DNA 순으로 빠르게 이동한다. 부하 전압이 높을수록 이동 속도가 빨라지며, buffer의 농도(이온강도)가 높을수록 DNA 분자의 이동이 빨라진다.
TAE buffer는 Tris, Acetate, EDTA 세 가지 성분으로 구성되어 있다. Tris는 양이온을 공급하여 음전하를 띠는 DNA를 끌어주며, Acetate는 높은 pH를 낮추는 역할을 한다. EDTA는 Mg2+, Ca2+ 같은 2가 양이온을 제거하여 DNase의 활성을 억제하고 DNA의 음전하를 유지시켜 줌으로써 전기영동 중 DNA 분해를 방지한다.
Ethidium bromide는 DNA 분자 사이에 끼어들어 결합하는 대표적인 염료이다. 이 염료는 DNA와 결합하면 강력한 발광을 하므로 UV 조사 시 DNA 밴드를 가시화할 수 있다. Loading dye는 DNA 시료의 밀도를 높여 well에 잘 들어가게 하며, 색깔을 부여하여 DNA가 어디까지 이동했는지 추적할 수 있게 해준다.
2. PCR 실험 과정
2.1. PCR 실험의 구성 및 조건
PCR 실험의 구성 및 조건이다. PCR은 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)의 약자로서 DNA 중합 효소를 이용하여 DNA의 양을 증폭시키는 기술이다. PCR 실험은 template DNA, primer, taq polymerase, dNTP, 10X buffer, D.W.(증류수)로 구성되어 있다. Template DNA는 증폭시키고자 하는 특정 DNA부분을 가지고 있는 주형이며, primer는 DNA 특정 부분의 유전자를 증폭하기 위해 선정된다. Taq polymerase는 핵산의 중합 반응을 일으...
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