미생물실험 보고서-Gram staining

소개

미생물 Gram(+), Gram(-)를 구분하는 실험 보고서 입니다.(Gram staining)

목차

1. Introduction

2. Material & Method

3. Result & Discussion

4. Reference

본문내용

1.Introduction.

(1) 염색을 위한 기초적인 조작법.
- 슬라이드준비: 슬라이드는 70%이상의 알코올로 씻어내야 한다.
- smearing: 슬라이드 위에 미생물 시료를 얇게 펴는 조작. 이때 smearing을 두껍게 하거나 균체를 너무 많이 해서는 안된다. 백금이로 미생물을 슬라이드에 옮겨 증류수와 골고루 섞으면서 얇게 피는 작업이다.
- heat fixation: 슬라이드 위에 smearing한 미생물을 건조시킨다. 이 미생물은 슬라이드 표면에 고정되어 있지 않아 염색조작 도중 유실될 우려가 있다. 이러한 현상을 방지하기 위해서 열고정 시켜야한다. 알코올 램프의 불꽃위로 슬라이드를 통과시키면서 세포 단백질이 열에 의해 응고되면서 슬라이드 표면에 고정된다.

(2) 그람염색
그람염색은 4가지 시약이 사용된다. 먼저 1차 염색시약으로 Crystal violet의 염기성 시양글 사용하며 이에 의해서 모든 세포는 보라색으로 염색된다. 그 다음 Crystal violettldir을 세포에 강하게 고정시키기 위해 Gram`s iodine 시약을 사용한다. 이는 1차 염색시약과 결합하여 불용성 화합물인 Crystal violet-iodine(CVI) complex를 형성하여 세포에 더욱 강하게 고정시키며 모든 세포는 짙은 자줏빛을 띠게 된다. 특히 그람 양성균은 세포벽의 Magnesium-ribonucleic acid가 CVI complex와 결합하여 Mg-RNA-CVI complex가 형성되는데 이것은 CVI complex보다 세포에 더욱 강하게 결합되어 제거하기가 더욱 어렵다. 여기에 탁색제로 지방용해와 단백질 탈수작용이 있는 95% 에틸 알코올을 사용하여 탈색시킨다. 이는 세포벽중의 지방 함유량이 높은 그람 음성균은 지방이 알코올에 녹아 세포벽에 큰 구멍이 생기고 세포벽 단백질의 탈수가 어느 정도 진행된다. 따라서 그람 음성균의 세포벽은 무색이 된다. 반면, 세포벽에 지방 함유량이 낮은 그람 양성균은 지방이 알코올에 의해 용출되어 미세한 구멍이 생겨 알코올에 의한 탈수작용은 막을 수 있다. 이로 인해 그람 양성균은 보라색을 유지한다. 마지막으로 대응염색제로 Safranin을 사용한다. 이 시약은 이미 탁색된 세포에 대하여 염색이 된다. 따라서 그람 음성균은 이 시약에 의해 분홍색으로 염색이 되고 그람 양성균은 여전히 보라색을 띠게 된다.

참고자료

· 미생물학실험서, 한국미생물학회, 정진숙, (주) 을유문화사. 1998.
· 식품미생물학, 강성태 윤재영 공저, 형성출판사, 2002.
· 식품미생물학 및 실험, 박영현 박훈 손천배 송은 이웅수 이진우, 보문객, 2005.