[서강대학교 현대생물학실험2] (4차 풀레포트) Site-directed mutagenesis, DNA sequencing

소개

"[서강대학교 현대생물학실험2] (4차 풀레포트) Site-directed mutagenesis, DNA sequencing"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials & Methods
4. Results
5. Discussion
6. References

본문내용

GFP(green fluorescent protein)은 빛을 흡수하여 형광을 방출하는 단백질로, GPF의 chromophore가 빛을 흡수하여 전자를 excitation시키고, 전자가 ground state로 돌아가며 형광을 방출한다. GFPuv는 GFP variant로, 자외선을 흡수하여 형광을 방출한다. 본 실험은 site-directed mutagenesis를 이용하여 GFPuv의 66Y와 145Y를 mutation하였다. Template plasmid는 Dam(DNA adenine methylase)에 의해 5’-GATC-3’ 서열의 adenine이 methylation되어있다. DpnⅠ은 methylation된 adenine을 포함한 GATC sequence를 절단하는 효소이다. 새롭게 합성된 DNA는 methylation되어 있지 않기 때문에 DpnⅠ에 의해 절단되지 않고 template만이 분해되게 된다. GFPuv와 mutation할 nucleotide를 가진 primer를 넣어 GFPuv, Y66H GFPuv, Y66H/Y145F GFPuv 3개의 sample을 조성하였다. 각 sample은 PCR 후 DpnⅠ을 처리하고, BL21에 transformation하여 배양하였고, 그 결과 Y66H GFP는 푸른 형광을 발광하는 것을 관찰할 수 있었으며, Y66H/Y145F GFP는 더 강한 형광을 발광하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 차이는 145 amino acid가 chromophore interaction amino acid이기 때문에 나타난 것으로 보인다. DNA sequencing은 DNA의 염기서열을 결정하는 작업으로, 본 실험은 dNTP(deoxynucleotide)와 ddNTP(dideoxynucleotide)의 구조적 차이를 이용한 sanger sequencing을 이용하였다. DNA sequencing 후 restriction enzyme site를 찾고..

<중 략>

참고자료

· Martz, M. V. (2002), Green Fluorescent Protein: Applications and Protocols, 1st edition, Humana Press, pp.36-37
· Giron, M. D. & Salto, R. (2011), 「From green to blue: Site-directed mutagenesis of the green fluorescent protein to teach protein structure–function relationships」, Biochemistry and Molecular Biology Education, 39(4), IUBMB journals, pp.309-315
· Heim, R. & Tsien, R. Y. (1996), 「Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer」, Current Biology, 6(2), Cell Press, pp.178-182