PlasmidDNA Purification & Sanger Sequencing 레포트

소개

Transformation plate(LBagar plate)에서 colony를 pick-up 후, plasmid DNA purification 진행 및 Sequencing을 통해 DNA Amplification과 Isolation이 제대로 진행되었는지 확인한 실험에 대한 레포트입니다.
레포트에 시간을 많이 들여 A+ 받았던 과목이기 때문에, 도움이 되실 거라 생각합니다.

목차

1. 실험 배경
1-1 Bacterial transformation
1-2 Liquid LB culture 및 Colony Inoculation
1-3 Plasmid purification
1-4 사용하는 Buffer의 종류 및 역할
1-5 Sanger Sequencing
1-6 Sequence 확인 및 Blast 프로그램

2. 실험 목적 및 방법 ---------------------------
2-1 실험 목적
2-2 실험 방법

3. 실험 결과 ----------------------------------
3-1 Chromas를 통한 sequence의 raw quality 확인
3-2 BLAST 결과
3-3 결론 및 고찰

4. 참고 문헌 ----------------------------------

본문내용

1. 실험 배경

1-1 Bacterial transformation
1) 정의
- 특정 DNA 조각을 Bacteria의 유전체 내로 삽입하여 새로운 genotype이 발현되도록 하 는 방법
- Bacteria에 외부 gene을 도입시켜 새로운 형질을 갖도록 하는 과정
- 외래의 DNA 분자가 Bacteiral cell에 도입되어 유전적인 변화가 일어나는 과정
2) 특징
① Bacterial plasmid는 restriction enzyme이 작용하는 multicloning site와 Selectable Marker로 사용하기 위한 antibiotic resistance gene을 가지고 있다.
② 외부의 유전 물질이 자유롭게 삽입될 수 있는 능력을 가지는 Competent cell을 필요로 한다.
③ PCR을 통해서 약 2kb의 짧은 DNA가닥만 증폭할 수 있다면, bacterial transformation을 통해서는 약 8kb의 긴 DNA조각을 bacterial plasmid에 삽입하여 복제 할 수 있다.
④ Bacterial transformation은 bacteria에 대한 연구뿐만 아니라 bacteria가 plasmid를 저장하고 복제하기 위한 수단으로 사용되기 때문에 중요하다.

1-2 Liquid LB culture 및 Colony inoculation
1) 정의
- 원하는 균주를 배양시킨 후, 생성된 single colony를 분리하여 liquid LB에 옮겨 충분히 성장시키는 과정
-> Luria Broth(LB)는 실험실에서 bacteria를 배양하는 데 일반적으로 사용되는 영양분이 풍부한 media이다.
2) 특징
① Plasmid DNA를 분리하기 전에 Liquid LB culture를 통해 bacteria를 충분히 성장시켜 서 많은 양의 plasmid DNA를 얻을 수 있다.

참고자료

· Bacterial transformation, Addgene: Protocol - Bacterial Transformation
· Inoculating a Liquid Bacterial Culture
· https://www.addgene.org/protocols/inoculate-bacterial-culture/
· Recovering Plasmid DNA from Bacterial Culture
· https://www.addgene.org/protocols/purify-plasmid-dna/
· NCBI, Reference sequence,
· https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_002467.6?report=fasta
· The Sanger Method of DNA Sequencing,
· The Sanger Method of DNA Sequencing - YouTube
· Vector Builder, DNA Reverse Complement Tool | VectorBuilder