Western Blot

목차

1. 정의 및 목적

2. 방법 및 원리
1) sample 준비
2) 전기영동
3) Transfer
4) Blocking
5) Antibody 반응 및 detection

3. 참고문헌

본문내용

Western blot은 찾고자 하는 protein의 antigen epitope과 반응하는 antibody를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질(antigen)만을 찾아내는 방법이다. 전기영동을 이용하여 단백질을 gel 상에서 크기에 따라 분리한 후, PVDF, nylon과 같은 membrane에 transfer한다.Membrane에 발광하는 probe가 붙어있는 antibody(항체)를 붙여주는 항원-항체 반응을 이용하여 찾고자 하는 특정 단백질을 검출한다. 여러 가지 단백질 중에서 원하는 단백질만을 보는 방법으로 fluorescence (fluorescein isothiocyanate), radioactivity, enzyme reaction (peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase) 등의 방법이 이용되고 있다.

<중 략>

sample 내의 단백질들은 전기영동에 의해 isoelectric point (등전점), molecular weight (분자량), electric charge (전하)에 따라 분리된다. SDS-PAGE는 단백질 질량의 차이에 따른 분리 방법으로, polyacrylamide gel과 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 넣은 완충용액을 이용한다. 환원제에 의해 sample이 변성된 후에는 단백질이 1차 구조를 형성하여 이동하므로, 단백질의 순수 분자량에 의해서만 분리할 수 있게 된다. sample 내의 단백질들은 (-) 전하를 띄는 SDS에 코팅되어 있기 때문에 acrylamide로 이루어진 망을 통과해서 (+) 전극으로 이동한다. Sample과 size marker를 well에 넣은 뒤 gel에 전압을 걸게 되면 단백질이 각각 다른 속도로 이동하게 되는데, 크기가 작은 단백질이 큰 protein 보다 빠른 속도로 이동하여 단백질이 크기에 따라 분리 된다. 이때, acrylamide 농도에 따라 gel의 분리능이 결정된다. Acrylamide 농도가 높을수록, 망의 구멍이 작아져 작은 분자들이 더 잘 분리될 수 있으며, acrylamide 농도가 낮을수록 망의 구멍이 커져 큰 분자량을 갖는 단백질들이 잘 분리된다.

참고자료

· https://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
· 재미있는 분자생물학 그림여행/ 유욱준, 신인철/ 분자방/ 2009
· http://www.genehunters.co.kr/Training/04.htm
· Protein methods/ Daniel M. Bollag 외/ Wiley-Liss/ 1999