분자생물학실험 논문

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없음

본문내용

Unknown DNA가 들어있는 pcc1fos plasmid를 여러 가지 제한효소로 잘라본 후, insert로 사용하기에 가장 적합하게 잘리는 제한효소를 선택한다. 선택한 제한효소로 pcc1fos와 vector인 pUC18 plasmid를 자른다. pUC18이 스스로 다시 붙지 않도록 CIP처리를 한 후, 잘린 pcc1fos와 pUC18을 Ligation하여 붙여준다. 각 enzyme 처리 후에는 phenol/chloroform extraction으로 enzyme의 활성을 죽이고 purify해준다. insert가 들어간 plasmid를 heat shock을 주는 방법으로 transformation하여 host에 넣어주고 이를 LB배지에 키워 cloning한 후 insert가 들어간 vector를 Blue/white screening 기법으로 구분하여 insert가 들어가 lacZ 자리가 변화된 white colony를 따서 insert 크기를 확인한다. 적당한 insert가 들어간 cell의 plasmid를 prep하여 sequencing을 통해 Unknown DNA의 sequence를 알아내고 blast, ORF finder등을 통하여 DNA의 정보를 알아낸다.

Material and Method
1) pUC18 Prep
material
pUC18, LB배지, conical tube, centrifuge,
solutionⅠ, solutionⅡ, solutionⅢ, pipette
wash solution, e-tube, column, 3’D.W, E.coli
method

<중 략>

Transformation 결과는 Blue/White screening 방법으로 알 수 있다. 상봉DNA가 삽입된 pUC18에는 ampicillin 저항성 유전자가 존재하기 때문에 ampicillin이 포함된 plate에 Host를 키우면 plasmid가 존재하는 cell은 해당 유전자로 인해 colony를 형성할 수 있고, transformation 되지 않은 cell은 plate 내에 생존할 수 없다. 즉, plate에 형성된 colony들은 모두 transformation이 된 cell이다. transformation된 plasmid에 insert가 삽입되었는지의 여부는 Blue/White screening8)을 통한 colony의 색을 통해 알 수 있다. 우리의 실험 결과에는 모두 white colony만 형성되었으므로 transformation된 cell 속의 plasmid는 모두 insert가 삽입된 plasmid인 것이다. colony의 색으로 ligation 결과가 성공적이었다는 것을 알 수 있다.

참고자료

· 위키피디아, 『HSP90』, http://en.wikipedia.org/wiki/Hsp90
· 위키피디아, 『Burkholderia thailandensis』, http://en.wikipedia.org/wiki/Burkholderia_thailandensis
· 강영희, "생명과학대사전", 아카데미서적, 2008.2.5, p67
· smatice37, 『Blue/White screening』, 2011.04.28, http://blog.naver.com/smatice37?Redirect=Log&logNo=70107809389