플라스미드의 분리와 DNA 전기영동 및 정량

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본문내용

Purpose :
분자 생물학 실험에서 플라스미드는 클로닝 벡터로 사용되기 때문에 매우 중요하다. 클로닝 벡터로 사용하기 위해서는 세포 밖으로 플라스미드를 분리하여야만 한다. 이번 실험에서는 알칼라인 용해법으로 플라스미드를 분리하고 분리한 DNA를 정량하여 전기영동 한다. 이로써 plasmid isolation 과 DNA전기영동의 원리를 이해해본다.

Materials :
키트 제품에 들어있는 Solution Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ, DNA 흡착수지 장치튜브, 세척액(washing solution), 멸균 증류수, 0.8% 아가로오스 젤, 6×loading dye(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 40% (w/v)sucrose in D.W.), TEA 완충액(0.04M Tris-acetate, 0.01M EDTA), EtBr 함유 염색 용액(EtBr staining solution), 마이크로 피펫, Vortex, 미량원심분리기(microfuge), 마이크로웨이브 오븐(microwave oven), 수평 전기영동장치, Trans-illuminator, 디지털 카메라.

<중 략>

Agarose gel 전기영동

겔 전기영동은 DNA나 RNA, 단백질과 같은 큰 분자들을 전기적인 힘을 이용하여 겔에서 이동시켜 크기에 따라 서로 분리하는 기술이다. 이 중에서 Agarose gel은 해상도가 다소 떨어지지만 100bp에서부터 50kb까지 비교적 큰 폭의 DNA단편을 분리할 수 있으며, 사용이 간편하고, 다루기 또한 쉬워서 가장 널리 사용되는 전기영동 재료이다. 주로 DNA 전기영동에 많이 사용된다. 더 작은 크기의 DNA분리를 위해서는 높은 농도의 agarose gel이나 Metaphor와 같은 특수한 agarose gel, 혹은 polyacrylamide gel을 사용한다.
전기장에서의 이동성은 완충용액의 이온 강도와 조성에 영향을 받는다. 이온강도가 너무 낮으면 DNA 이동이 느려지고, 이온 강도가 너무 높으면 열이 발생하여 심한 경우 gel이 녹거나 DNA의 구조가 변하게 된다. 실험실에서 많이 사용하는 buffer는 TAE와 TBE이다.

참고자료

· http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_13.php
· http://mybox.happycampus.com/opisc/3696663
· http://www.genehunters.co.kr/Training/01_4.htm
· http://www.genehunters.co.kr/Training/01_4.htm
· http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_20.php
· http://monet_vera.blog.me/50079110424
· http://silencesea.egloos.com/3607391
· 유전자의 분자생물학/watson/1995년/p736~739
· 임상 분자생물학/대학대림/1995sis/p95~97