약리학 실험보고서<RT-PCR을 이용한 특정 유전자 과발현 측정>

소개

 RT-PCR을 이용하여 외부 자극에 의해 특정 유전자의 과발현을 확인함으로써 환경오염물질에 의한 인체상피세포의 특정 과발현 유전자를 측정하는 실험입니다.

목차

 실험날짜
 실험목적
 실험이론 및 원칙
-RT-PCR
-GAPDH
-TCDD
 실험방법
 실험결과
 고찰과 결론

본문내용

♣RT-PCR
PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA를 template로 해서 DNA를 증폭하는 효소(DNA-dependent DNA polymerase)이므로 RNA로부터 직접 증폭할 수 없다. 따라서 RNA를 template로 할 경우는 일단 DNA로 복사한 다음 증폭한다. 이 경우는 PCR을 시행하기 이전에 RNA로부터 DNA를 합성해 주는 효소인 reverse transcriptase를 처리한다. 맨 먼저 reverse transcriptase로 RNA를 complementary DNA(cDNA)로 역전사한다. 이 때 쓰이는 primer는 downstream primer뿐이다. 왜냐하면 RNA는 single strand이기 때문이다. 그 후 생성된 cDNA에서 일반적인 PCR의 과정을 밟아서 유전자를 증폭한다.
♣GAPDH
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase로 subunit은 약 37kDa이고 이들은 tetramer이다. 이들은 세포내 세포질과 핵에서 glycolysis, membrane fusion, microtubule binding, phosphotransferase activity, nuclear RNA export, DNA repair, Neurodegenerative disease 등에서 중요한 기능을 한다. 따라서 세포에 반드시 필요한 단백질이므로 세포에 가해지는 어떤 자극하에서도 그 발현 정도의 차이거 거의 없어 actin, tubulin등과 함께 실험의 control로 많이 쓰인다.
♣TCDD
쓰레기를 태울때 나오는 맹독성 물질로 70여 종의 다이옥신 중 독성이 가장 강하다.
◆ 실험방법
전체 실험 과정을 크게 세 가지로 나눌 수 있다.
(1) RNA 분리
(2) cDNA 합성
(3) PCR amplification

(1) RNA 분리 과정
1. 조직에 1ml의 Trizol을 넣고 200ml의 chloroform을 넣는다.(단백질제거)
2. 튜브를 15초 동안 vortex에 넣고 5분 동안 얼음에 둔다.

참고자료

· 없음