연세대학교 생화학실험(2) - RT-PCR analysis

소개글

isolation된 RNA를 이용하여 oligo-dT primer를 이용한 RT-PCR을 해보고, cell 종류에 따른 gene 발현의 차이를 확인해보며 그 원리를 확실하게 이해한다.

목차

◆ 실험일자
◆ 제출자
◆ 목적
◆ 원리
◆ 시약 및 기자재
◆ 방법
◆ 결과
◆ 고찰
◆ Further study

본문내용

◆ 목적 : isolation된 RNA를 이용하여 oligo-dT primer를 이용한 RT-PCR을 해보고, cell 종류에 따른 gene 발현의 차이를 확인해보며 그 원리를 확실하게 이해한다.

◆ 원리
*RT-PCR
원래 PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA-dependent DNA polymerase이므로 RNA로부터 직접 증폭할 수 가 없다. 따라서 RNA를 template로 PCR을 하기 위해서는 먼저 DNA로 복사한 다음(cDNA) 증폭한다. 이 때, RNA를 주형으로 DNA를 만들기 위해 RNA-dependent DNA polymerase인 Reverse Transcriptase를 사용하기 때문에 이러한 방법을 RT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)이라고 한다.
RT-PCR은 앞에서 말한 것과 같이 PCR을 하기 전에 먼저 RNA로부터 reverse transcriptase를 이용하여 cDNA(complementary DNA)를 만들어야 한다. 이때, RNA는 single strand이기 때문에 primer는 downstream primer 하나만 사용한다. 그 후 생성된 cDNA에서 일반적인 PCR의 과정을 밟아서 유전자를 증폭한다.
downstream primer를 만들 때에는 는 아래와 같은 세 가지 방법을 사용할 수 있다. 첫 번째는 mRNA 뒤에 poly A tail이 붙는 것을 응용한 oligo dT primer로, 많은 RNA중, poly A tail이 있는 mRNA만 cDNA로 만들 수 있다. 두 번째, gene specific primer는 원하는 gene만 역전사되기 때문에 target gene의 cDNA만을 합성할 때 사용된다. 그리고 sequence만 맞으면 어디든지 붙는 random primer는 길이기 짧고, 아무 염기서열로도 만들 수 있다. 이 random primer를 사용하면 mRNA뿐만 아니라 rRNA, tRNA 등 모든 RNA를 cDNA로 만들 수 있다.

참고 자료

-생화학실험(2) 실험교본, 연세대 생화학과 chapter11.
-분자세포생물학, 대표역자 이한웅, worldscience, p67-69.
-http://www.bio-medicine.org/biology-products/Recombinant-RNasin-3Csup-3E-26-23x00AE-3B-3C-sup-3E-Ribonuclease-Inhibitor-from-Promega-1064-1/
-http://www.promega.com/catalog/catalogproducts.aspx?categoryname=productleaf_1573