BRADFORD 시약을 이용한 단백질 정량

소개

BRADFORD 시약을 이용한 단백질 정량

목차

실험 일자
실험 주제
실험 원리
실험 과정
실험 결과

본문내용

실험 일자 : 2009년 4월 15일

실험 주제 : BRADFORD 시약을 이용한 단백질 정량

실험 원리 : 분광광도계로 단백질의 농도를 측정할 때, BRADFORD시약 속의 염료인 CBB G-250 시약이 단백질과 결합하기 전(465nm)과 결합한 다음(595nm)의 흡수되는 파장 영역이 달라짐에 따라 최대 흡광도 영역이 달라지는 원리를 이용하여 단백질의 농도를 측정하는 정량법이다. CBB G-250 시약은 Protein과 결합하면 밝은 파란색으로 변한다. 단백질의 정량을 위해서는 standard가 필요한데, BSA(Bovine Serum Albumin)를 이용해 standard curve를 얻을 수 있다. 여러 농도의 BSA를 만들어 dye를 넣은 후 반응시켜 595nm에서 흡광도 측정을 하고 그 결과값을 이용해 standard curve를 그린다. 이 때 curve는 직선형에 가까울수록 신뢰도가 높아진다. 그런 다음 정량하고자 하는 단백질(E.coli cell)이 들어있는 sample을 dye처리해 흡광도를 측정해 BSA(or BGG)의 값과 비교해보면, BSA는 이미 농도를 알고 있으므로 sample의 흡광도 결과를 이용해 sample의 농도를 계산할 수 있게 된다.

실험 과정 :
1. PBS 완충액으로 단백질을 6배 희석법으로 희석한다.
PBS 500µl와 BSA 100µl가 들어있는 sample에서 100µl를 PBS 500µl가 들어있는 tube로 옮긴다. (1/6 희석) 그리고 그것을 또 다시 PBS 500µl가 있는 tube에 옮긴다. (1/62 희석) 같은 과정을 한 번 더 한다. (1/63 희석)
2. PBS 단백질 혼합액과 BRADFORD 시약(1/2 희석액)을 넣어 혼합하여, 5분간 정치한다.
BRADFORD를 넣자 첫 번째 tube는 제일 맑고 파란색이었고, 두 번째 tube는 남색계열의 푸른색, 세 번째 tube는 뿌연 연하늘색, 네 번째 tube는 뿌옇고 회색이었다. 단백질의 양이 적어짐에 따라 BRADFORD 시약과 단백질의 혼합액의 색이 뿌옇게 되었고, 푸른색을 잃었다.
3. 분광광도계를 미리 작동시켜 예열한 다음 지정된 파장에서 측정한다.
Cuvette에 시료를 담아 분광광도계의 빛이 투과 가능하도록 한다. Cuvette을 사용할 때의 주의점은 재사용할 때에는 깨끗이 닦아내고, 매끈한 면을 손으로 만지면 오염되어 굴절률에 이상이 있을 수 있기 때문에 그 부분은 손을 대지 말아야 한다.

참고자료

· 없음