Inonotus obliquus 의 균사체 액상배양에서 원형질체 형성과 돌연변이를 통한 단백다당체 고생산성 균주 개발 (Strain Improvement through Protoplast Formation and Mutation of Inonotus obliquus Mycelia for Enhanced Production of Innerpolysaccharides (IPS) in Suspended Mycelial Cultures)

서지정보

· 발행기관 : 한국생물공학회
· 수록지 정보 : KSBB Journal / 25권 / 2호 / 155 ~ 166페이지
· 저자명 : 홍형표, 정용섭, 전계택

초록

천연물 유래 생리활성물질 및 기능성 식품의 개발을 통한 질병의 치료 및 예방에 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있는 약용버섯은 분류학상 균류 (Fungi) 중 진균류(Eumycetes)에 속하며 대부분은 담자균류 (Basidiomycetes)의 일종이다 [1,2]. 약용버섯은 단백질, 아미노산, 비타민,무기염류, 당 등과 같이 인체에 중요한 각종 영양성분을함유하고 있고 광범위한 약리작용을 가지고 있어 전통적으로 민간의약 제제로 널리 활용되어 왔다 [3,4]. 최근 여러종류의 버섯자실체 및 균사체 추출물 중에서 특별히 면역증강작용에 의해 탁월한 항암효능과 당뇨병 개선효과를 보이는 생리활성물질은 β-D-Glucan 구조를 갖는 수용성 단백다당체 (향후 “단백다당체”로 명명함)로 구성되어 있음이 밝혀졌다 [5,6,7,8]. 일본의 경우 기능성 식품으로 표고버섯균사체 추출물이 이미 일반화 되어 있으며, 의약품의 경우면역증강효과에 의한 암치료 (보조)제로 사용되고 있다.
구름 (운지)버섯 배양 균사체에서 추출한 단백다당체인PSK는 항암성 면역증강제인 Krestin으로, 치마버섯 균사체배양의 배양여액에서 추출한 세포외다당체인 Shizophyllan 은 항암성 면역증강제인 Sizofilan 주사제로, 그리고 표고버섯 자실체에서 추출한 단백다당체는 항암성 면역증강제인 Lentinan 주사제로 판매되고 있다.
항당뇨효과 및 항암효과가 특히 뛰어난 것으로 알려진세포벽 단백다당체 (innerpolysaccharides) (IPS) [9]의 생산균주이며 담자균류에 속하는 Inonotus obliquus는 최소5년 이상 성장해야 포자가 형성되고, 통상 10~20년 이상자라야 채집이 가능한 것으로 알려져 있다. 담자균류의 면역증강 작용의 항암성분 [10,11,12]으로 밝혀진 IPS는 특별히 고안된 정제과정을 거쳐 정제된 조단백다당체 내에도 5% 이하의 함량을 나타내는 미량성분이다 [13,14]. 최근 들어 인공재배에 의해 자실체를 생산하고 있으나 긴생산기간과 낮은 생산성으로 인해 소비자가 원하는 저렴한 가격에 판매가 어려운 실정이다. 현재까지 I. obliquus 에 대한 대부분의 연구는 고체배양을 통하여 얻어진 자실체 추출물의 약리작용 및 약효성분, 구조분석에 관한 것이주를 이루고 있을 뿐 액체배양을 통하여 균사체를 대량으로 배양하고 이로부터 IPS를 대량 생산하는 연구는 부족한 실정이다. 자실체의 고체배양에 의해 IPS를 생산하는방법은 대량생산 시 품질관리가 힘들며 자실체 재배를 위한 많은 노동력과 시간이 요구됨에 따라 생산성도 떨어지는 단점이 있다 [15,16]. 이와는 대조적으로 균사체 액상배양을 통한 IPS 생산공정은 기존의 고체배양을 통해 자실체를 생산하는 방법에 비해 보다 잘 규명된 조건하에서대량 생산이 가능하며, 배양기간 또한 단축시켜 생산성을높일 수 있는 장점이 있다 [17,18,19].
I. obliquus 균사체의 액상배양에 의한 단백다당체의 산업적인 대량생산을 위해서는 고생산성 균주의 확보가 핵심적인 관건이다. 고생산성 균주를 개발하기 위해서는 최종 생산배양에서 선별된 균주들의 IPS 생산성을 확인해야하는데, 이를 위해서는 다음의 일련의 배양공정을 거쳐야한다: 단일 콜로니를 얻기 위한 원형질체 형성 및 재생 -고체성장배지에서의 계대배양 - 정치배양 - 플라스크에서의 성장 액상배양 - 플라스크 액상 생산배양 또는 발효조액상 생산배양. 본 연구에서는 I. obliquus 균사체의 액상배양에 적합하고, 동시에 IPS 고생산성의 특성을 갖는 우량균주를 획득하는 방법을 개발하고자 하였다. I. obliquus 의 경우 균사체 액상배양 시 포자를 형성하지 않기 때문에 동일한 유전자를 보유한 단일균주의 선별이 어려운데,배양공정의 안정성과 재현성을 위해서는 고생산성의 단일균주 개발이 필수적이다. 따라서 본 연구에서는 균사체로부터 세포막을 제거하여 형성된 원형질체로부터 단일 핵을 보유한, 성장속도가 우수한 우량 균주를 선별하여, 이로부터 유효성분인 IPS를 고함유하는 고생산성 균주를 개발하고자 하였다. 이를 위해 원형질체 재생을 위한 재생배지 및 고체 성장배지에서 빠른 성장속도를 보이는 생산균주를 분리하여 플라스크 액상 생산배양을 통해 이들의 배양 생리적 특성을 재조사한 후, 이로부터 IPS 고생산성의생산균주를 최종 선별하고자 하였다.

영어초록

Studies on the production of cell-wall bound innerpolysaccharides (IPS) (soluble β-D-glucan) have been performed by use of suspended myelial cultures of Inonotus obliquus. This product has promising potentials as an effective antidiabetic as well as an immunostimulating agents. As a first step to enhanced production of IPS, Intensive strain improvement programs were carried out by obtaining a large amounts of protoplasts for the isolation of single cell colonies. Rapid and large screening of high-yielding producers was possible because about fivefold higher amount of protoplasts (2.3 x 10⁶ protoplasts/mL) could be recovered with relatively high regeneration rates of 10⁻²~10⁻³ by applying a modified filtration method, as compared to the previously used trapping method. A basic protocol necessary for UV-mutation of the protoplasts was also developed, resulting in several overproducing variants with good fermentation properties. Since the amount of IPS extracted from the mycelial cell walls of I. obliquus turned out to be almost constant per g DCW, increase in cell mass was considered the most important factor for the enhancement in IPS production. Therefore, attempts were made to screen mutant cells showing rapid mycelial growth rate in the final suspended cultures. Notably, the mutant strains showing an active cellgrowth in the preceding solid growth cultures were observed to produce higher amount of IPS in the suspended fermentations as well. A striking mutant, OBLQ756-15-5 strain, obtained from the survivors of a harsh UV-treated condition (97% death rate) was found to stably produce as high cell mass as 22 g DCW/L in the final fermentations. Currently, this strain is being tested for development of a scaled-up fermentation process for mass production of IPS.

참고자료

· 없음