고초균을 이용한 재조합 인간 골 형성 단백질-7의 발현과 정제 (Expression and Purification of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-7 (rhBMP-7) in Bacillus subtilis)

서지정보

· 발행기관 : 한국생물공학회
· 수록지 정보 : KSBB Journal / 25권 / 3호 / 257 ~ 264페이지
· 저자명 : 김춘광, 오성덕, 이종일

초록

골 형태 형성 단백질 (bone morphogenetic protein, BMPs)은 β형 전환 성장인자 (transforming growth factor β, TGF-β)슈퍼패밀리 (superfamily)에 속하는 펩타이드 성장 인자이다. BMPs는 포유동물에서 조직 줄기세포 (stem cell)에 작용하여 골 세포 및 연골 세포로 분화를 촉진시키는 역할을하는 것으로 알려져 있다 [1]. 그리고 BMPs가 속해있는 β형전환 성장인자 슈퍼패밀리의 특징은 성숙한 부분 (mature region)에 7개의 시스테인이 매듭을 형성하여 이중합체를이루는 것이 특징이다 [2]. 1965년 Urist가 여러 종류의 산성용액으로 탈회한 골 기질을 근육과 피하에 이식하였을 때이소성 연골이나 골의 분화가 일어난다는 사실을 처음 밝혔으며 [3], 태생기 또는 그 이후에 미분화 골 형성 전구세포를 분화시키는 물질을 발견하여 BMP라 명명하였다 [4].
이후 기능적 생물 검정을 통하여 BMP를 정제하였으며,분자 클로닝과 재조합된 인간 BMP (rhBMP)의 발현으로각종 BMP를 발견하여 분류하였다 [5-7]. 지금까지 15종류의 BMP가 밝혀져 있으며 이 중에서 골 형성을 유도하는것으로 확인된 것은 5종으로 BMP-2 (BMP-2a), BMP-3(Osteogenin), BMP-4 (BMP-2b), BMP-6 (human homologue of the murine, Vgr-1), BMP-7 (Osteogenic protein-1)이Fig. 1. Construction of an expression vector for rhBMP-7 gene.
다 [8-10]. 이들 중 재조합 DNA 기술에 의해 포유류 세포(CHO cell)로부터 얻어지는 rhBMP-2와 rhBMP-7의 골 유도능이 가장 우수하다고 보고되어 이를 이용한 연구가 많이이루어졌으며, 현재까지도 주로 생산되어 연구재료로 사용되고 있다. 즉, 유전자 재조합에 의해 생산된 rhBMP-2와rhBMP-7 단백질을 근 골격계 재생에 이용한 임상 연구들이 보고되었다 [11,12]. BMPs의 재조합 생산은 원핵세포와 진핵세포의 배양 시스템에서 모두 가능하다. 원핵세포배양 시스템에서는 포유류 발현 벡터를 통해 완전구조 유전자 (full-length cDNA)를 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell, CHO cell)에 감염시켜 최초로 rhBMPs 를 생산했다 [13]. 그러나, 포유류 세포로부터 생산되어지는 rhBMPs는 생산 수율이 낮으며, 중국 햄스터 난소 세포와아프리카 푸른 원숭이 신장 세포 (COS cell) 시스템을 사용하여 높은 수준의 BMPs 발현이 어렵다고 보고하였다 [1,14].
한편, 진핵세포를 이용한 경우 배양 시스템의 구조가 단순할 뿐만 아니라 배양이 용이하며 다수의 개체를 취급하기 쉬운 대장균 (E. coli)을 단백질 발현에 많이 사용하였다 [17].
그러나 대장균을 이용하여 BMPs를 생산하는 경우 봉입체(inclusion body)의 형성으로 생체 밖 (in vitro)에서 재접힘(refolding)을 통해 활성형 BMPs로 만들어야하는데, 재접힘과정이 복잡하고 재접힘 완충용액이 비싼 시약을 포함할뿐만 아니라 총 수율이 낮은 단점을 가지고 있다 [15-17].
최근, 외래 단백질의 대량생산을 위한 숙주세포로써 그람양성균인 고초균 (B. subtilis)이 사용되고 있는데, 고초균은미국 식품 의약국 (FDA)으로부터 안정성과 내독성이 없는 균주로 승인 (generally recongnized as safe, GRAS)되었다. 또한, 고초균은 발현된 단백질을 배양액으로 직접적으로 방출하기 때문에 세포 파쇄의 과정이 생략되어 단백질 정제가 간소화되고 세포질에서 봉입체의 형성이 감소됨에 따라 활성형단백질의 생산이 용이하다 [18]. 이러한 다양한 장점으로 고초균은 산업규모의 발효에서 유용균주로 사용되고 있다 [19].
본 연구에서는 고초균을 rhBMP-7 유전자의 발현 시스템으로 사용하여 rhBMP-7의 발현과 생산에 대한 연구를 하고자 한다. 그리고, 생산된 rhBMP-7을 정제하고 MC3T3-E1세포에서 알칼라인 포스파타제 활성도 (alkaline phophatase activity, ALP activity)를 측정함으로써 rhBMP-7의 생물학적 활성을 조사하고자 한다.

영어초록

Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) is one of important growth factors for skeletal development and bone growth. In this work, BMP-7 was efficiently expressed in recombinant Bacillus subtilis. The mature BMP-7protein indicated molecular weight of 15.4 kDa by Western blot assay and was secreted into culture medium with 0.35 ng/mL. The extracellular and intracellular rhBMP-7 proteins were purified by using a FPLC system with an ion exchange column and a gel filtration column. The extracellular and intracellular rhBMP-7 proteins had finally a 57.1% purity and a 36.2% purity, respectively. The purified rhBMP-7 proteins showed an intact biological activity which stimulated alkaline phophatase (ALP) activity in MC3T3-E1 cells.

참고자료

· 없음