Plasmid purification & DNA 정량 A+ report

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문서 내 토픽

• 1. Plasmid DNA transformation

  Plasmid DNA transformation이란 특정 종의 세포에 외부 유전자를 도입하여 그 세포가 새로운 유전자 정보를 표현하도록 하는 과정이다. 간단히 말해, ligation된 plasmid를 숙주세포 안으로 넣어주는 것이다. 일반적으로, plasmid는 작은 원형 DNA 조각으로서 bacteria와 같은 원핵생물의 세포외부에서도 독립적으로 복제할 수 있는 DNA이다. 특정 유전자 조각을 plasmid에 삽입한 후, host cell에 도입해서 해당 유전자가 host cell의 유전자로 통합되어 새로운 특성을 나타나게 만든다.

• 2. Plasmid DNA extraction

  Plasmid DNA는 재조합 DNA 조작을 위한 운반체 DNA로 사용되는데, 이 운반체 DNA를 Vector라고 한다. 주로 대장균에 vector를 삽입하는데 이 과정을 Bacterial transformation이라고 한다. Vector를 cell에 도입한 뒤, 선별을 위해 ampicillin이 함유된 배지에서 키우는 과정을 진행한다. Ampicillin이 함유된 배지에서 자라난 colony는 bacterial transformation이 성공한 cell이다. 대장균 cell에는 plasmid DNA와 대장균 cell의 염색체 DNA인 chromosomal DNA가 독자적으로 존재하기 때문에 plasmid DNA를 따로 분리하여야 한다. Cell에서 plasmid DNA를 따로 분리하는 과정을 Purification of plasmid DNA라고 한다.

• 3. Alkali lysis

  Alkali lysis는 mini-prep의 한 종류로 용액의 pH를 이용하여 plasmid DNA를 분리하는 방법이다. Alkali lysis는 Re-suspension, Cell lysis, Neutralization, Cleaning and Concentration 순서로 진행하게 된다. Re-suspension 단계에서는 S1 buffer를 사용하게 되는데, 이 buffer는 glucose, EDTA(chelator), Tris 등이 함유되어 있다. Cell lysis 단계에서는 S2 buffer를 사용한다. S2 buffer는 강알칼리인 NaOH와 계면활성제인 SDS가 함유되어 있다. Neutralization 단계에서는 S3 buffer를 사용한다. S3 buffer를 첨가하게 되면 용액의 알칼리도가 감소하게 되고 중성 상태에서 DNA는 다시 변성 전 상태로 되돌아간다.

• 4. Mini-prep (Plasmid DNA purification)

  Mini-prep이란 transformation된 E.coli를 배양한 뒤, E.coli에 있는 plasmid DNA를 정제하는 것을 말한다. Plasmid DNA를 증폭시키기 위해선 transformation을 통해 bacterial cell 안으로 plasmid DNA를 넣고 세포를 배양한다. 이후 충분히 늘어난 세포들을 모아 그 안에서 plasmid DNA만을 추출하고 정제하는 과정을 Plasmid DNA purification 이라 한다. Mini-prep은 상대적으로 적은 양의 DNA를 얻는 데에 적합하다.

• 5. Nanodrop

  Nanodrop은 sample 안의 DNA, RNA, protein의 농도와 이의 품질을 측정하는 데 사용되는 spectrophotometer이다. Nanodrop을 통해 측정할 때엔 적은 용량만 가지고도 값을 측정할 수 있고, 사용이 간편하고 빠르게 결과가 나온다는 장점이 있다. Nanodrop의 작동원리는 UV-Vis 스펙트럼 측정에 기반한다. DNA, RNA와 같은 핵산은 260nm에서, 핵산 이외의 정제 단백질은 280nm에서, Phenol과 EDTA와 같은 시약 속의 organic compound는 230nm에서 빛을 peak로 흡수한다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. Plasmid DNA transformation

  Plasmid DNA transformation is a fundamental technique in molecular biology and genetic engineering. It involves the introduction of foreign DNA, typically a plasmid, into a host cell, such as bacteria or yeast, to confer new genetic properties. This process is crucial for various applications, including gene cloning, protein expression, and genetic manipulation. The ability to transform cells with plasmid DNA has enabled researchers to study gene function, develop therapeutic proteins, and create genetically modified organisms. Mastering plasmid DNA transformation is a crucial skill for anyone working in the field of molecular biology or biotechnology.

• 2. Plasmid DNA extraction

  Plasmid DNA extraction is a crucial step in many molecular biology and genetic engineering experiments. It involves the isolation and purification of plasmid DNA from host cells, such as bacteria or yeast. Efficient plasmid DNA extraction is essential for downstream applications, such as DNA sequencing, restriction enzyme analysis, and genetic manipulation. The ability to obtain high-quality, pure plasmid DNA is crucial for ensuring the success of these experiments. Plasmid DNA extraction techniques have evolved over time, with various methods available, each with its own advantages and disadvantages. Mastering plasmid DNA extraction is a fundamental skill for researchers working in the field of molecular biology and biotechnology.

• 3. Alkali lysis

  Alkali lysis is a widely used technique for the extraction of plasmid DNA from bacterial cells. This method involves the use of a strong base, such as sodium hydroxide (NaOH), to disrupt the bacterial cell membrane and denature the chromosomal DNA, while leaving the smaller, circular plasmid DNA intact. The plasmid DNA is then selectively precipitated and purified, allowing for the isolation of high-quality plasmid DNA. Alkali lysis is a simple, efficient, and cost-effective method for plasmid DNA extraction, making it a popular choice for many molecular biology and genetic engineering applications. Understanding the principles and proper execution of alkali lysis is essential for researchers working with plasmid DNA.

• 4. Mini-prep (Plasmid DNA purification)

  Mini-prep, or plasmid DNA purification, is a widely used technique in molecular biology and genetic engineering. It involves the small-scale isolation and purification of plasmid DNA from bacterial cultures. Mini-prep protocols typically use a combination of alkaline lysis, selective precipitation, and column-based purification to obtain high-quality plasmid DNA. This technique is essential for various applications, such as DNA sequencing, restriction enzyme analysis, and genetic manipulation. The ability to efficiently purify plasmid DNA in small quantities is crucial for researchers working with limited sample sizes or screening multiple bacterial colonies. Mastering the mini-prep technique is a fundamental skill for anyone working in the field of molecular biology or biotechnology.

• 5. Nanodrop

  The Nanodrop is a widely used spectrophotometric instrument for the quantification and quality assessment of nucleic acids, such as DNA and RNA. It allows for the rapid and accurate measurement of sample concentration and purity, making it an essential tool in molecular biology and biotechnology laboratories. The Nanodrop's ability to analyze small sample volumes, typically in the range of 1-2 microliters, makes it particularly useful for working with limited sample sizes. Additionally, the Nanodrop provides information on the sample's purity by calculating the A260/A280 and A260/A230 ratios, which are important indicators of potential contaminants. Mastering the use of the Nanodrop and understanding its principles and limitations is crucial for researchers working with nucleic acids, as it enables them to make informed decisions about sample quality and concentration, which is essential for the success of downstream applications.