HPLC 분석을 위한 검량선 작성 및 시료전처리 방법

본 내용은 " 검량선 작성법, 시료전처리방법(단백질 침전법, 고체상 침전법, 액체-액체 침전법), HPLC-UV 그래프 결과분석 레포트 " 의 원문 자료에서 일부 인용된 것입니다. 2023.12.07

문서 내 토픽

• 1. 검량선 작성법

  크로마토그래피 정량분석에서 피크 면적이나 높이가 시료 농도에 비례한다는 원리를 이용하여 검량선을 작성한다. 절대검량선법(외부표준법)은 표준물질의 크로마토그래피 결과로부터 성분량을 X축, 피크 넓이를 Y축으로 하여 검량선을 작성하는 방법이다. 내부표준법은 정량 성분과 내부표준물질의 비를 X축에, 피크 넓이의 비를 Y축에 취하여 검량선을 작성하며, 주입량 정확성이 필요 없고 검출기 반응 변화에 영향을 받지 않는 장점이 있다.

• 2. 시료전처리 방법

  시료의 오염을 방지하고 정확한 분석결과를 위해 진행하는 단계로, 단백질 침전법(PP)은 유기용매를 첨가하여 단백질을 변성시켜 제거하는 방법이다. 고체상 추출법(SPE)은 고체상 추출제를 이용하여 방해성분을 선택적으로 제거하거나 목적 성분을 농축·정제하는 방법이며, 액체-액체 추출법(LLE)은 유기용매를 이용하여 목표 화합물을 분배 차이로 추출하는 방법이다.

• 3. HPLC 검출기 및 분석 원리

  UV-vis 검출기는 특정 발색단을 가진 유기화합물이 UV 또는 가시광선을 흡수하는 원리로 흡광도를 측정한다. PDA 검출기는 UV-vis와 동일한 원리이나 가능한 영역대의 모든 파장을 검출할 수 있어 입체적 분석이 가능하다. 이동상 조성, 고정상 화학, 온도 등이 HPLC 분리에 영향을 미치며, 역상 크로마토그래피에서는 극성도가 높은 용매의 비율이 높을수록 머무름 시간이 증가한다.

• 4. 내부표준물질(IS)의 역할

  내부표준물질은 분석하려는 시료에 들어있지 않은 물질로, 표준용액과 시료용액에 일정량을 첨가하여 외부표준법에서 발생할 수 있는 주입량 변화에 따른 오차를 방지한다. 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적 비를 이용하여 검량선을 작성함으로써 기기적 오차를 보정하고 정확한 실험결과를 도출할 수 있다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. 검량선 작성법

  검량선 작성은 분석화학에서 가장 기본이 되는 정량분석 기법입니다. 표준물질의 농도와 측정값 사이의 선형관계를 확립함으로써 미지시료의 농도를 정확하게 결정할 수 있습니다. 검량선의 정확성은 표준물질의 순도, 농도 범위의 적절성, 측정 조건의 일관성에 크게 좌우됩니다. 특히 분석 대상 물질의 농도 범위 내에서 충분한 수의 표준점을 설정하고, 각 점에서의 반복 측정을 통해 신뢰도 높은 검량선을 구축하는 것이 중요합니다. 회귀분석을 통해 결정계수(R²)를 확인하여 선형성을 검증하는 과정도 필수적입니다.

• 2. 시료전처리 방법

  시료전처리는 분석 결과의 정확성을 좌우하는 매우 중요한 단계입니다. 복잡한 기질 성분을 제거하고 목표 분석물을 농축하는 과정으로, 적절한 전처리 없이는 신뢰할 수 있는 분석 결과를 얻을 수 없습니다. 액액추출, 고체상추출, 침전 등 다양한 방법이 있으며, 분석 대상 물질의 특성과 시료의 기질에 따라 최적의 방법을 선택해야 합니다. 전처리 과정에서의 손실을 최소화하고 회수율을 높이기 위해 각 단계를 체계적으로 최적화하는 것이 필수적입니다.

• 3. HPLC 검출기 및 분석 원리

  HPLC는 현대 분석화학에서 가장 널리 사용되는 기기분석 기법이며, 검출기의 선택은 분석의 성공을 결정하는 핵심 요소입니다. UV-Vis 검출기는 자외선을 흡수하는 물질에 효과적이고, 형광 검출기는 높은 선택성과 감도를 제공합니다. 질량분석기(MS)는 화합물의 구조 정보까지 제공하여 확인 분석에 매우 유용합니다. 각 검출기의 원리를 이해하고 분석 대상 물질의 특성에 맞는 검출기를 선택하면 정확하고 신뢰할 수 있는 분석 결과를 얻을 수 있습니다.

• 4. 내부표준물질(IS)의 역할

  내부표준물질은 시료 전처리 과정에서의 손실, 기기 감도 변화, 주입량 편차 등 다양한 오류 요인을 보정하는 데 매우 효과적입니다. 분석물과 유사한 물리화학적 특성을 가지면서도 분석물과 구분될 수 있는 물질을 선택하는 것이 중요합니다. 내부표준물질을 사용하면 절대정량보다는 상대정량을 수행하게 되어 분석의 정확성과 정밀성이 크게 향상됩니다. 특히 복잡한 시료 기질에서의 분석이나 기기 조건이 불안정한 상황에서 내부표준물질의 사용은 신뢰할 수 있는 정량분석 결과를 보장합니다.