SDS-PAGE and Protein Analysis

문서 내 토픽

• 1. SDS의 역할 및 SDS-PAGE 원리

  SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)는 계면활성제로서 친수성과 소수성 부분을 모두 지니고 있으며, 단백질을 변성할 수 있는 물질이다. SDS-PAGE는 이러한 SDS의 특성을 토대로 하여 단백질을 분자량에 따라 band 형태로 분리하는 실험이다. 단백질은 그 구조와 전하, 분자량이 모두 다르기 때문에 SDS를 통해 단백질의 구조와 전하를 모두 일정하게 한 뒤 분자량에 의해서만 분석을 진행한다.

• 2. Gel에 들어가는 시료의 역할

  Acrylamide와 N,N'-Methylene-bisacrylamide를 혼합한 용액을 제조하여 polymerization 된 acrylamide 사이를 cross-linking 하여 그물(net) 구조의 polyacrylamide gel을 형성한다. APS(Ammonium persulfate)는 free radical polymerization의 initiator로서 작용하며, TEMED(Tetramethylethylenediamine)가 free radical 형성의 catalyst로 서 작용하여 polyacrylamide gel 형성을 촉진한다. SDS는 단백질 변성 및 음전하화에 기여하고, Tris-HCl은 buffer로서 용액의 pH 변화를 막는다.

• 3. Resolving Gel과 Stacking Gel의 차이

  Stacking gel은 각 단백질이 gel에서 일렬로 정렬되도록 하고, resolving gel은 단백질의 분자량에 따른 이동 속도의 차이를 극대화한다. Stacking gel은 pH 6.8, 5% polyacrylamide 농도를 사용하고, resolving gel은 pH 8.8, 8% polyacrylamide 농도를 사용한다.

• 4. Coomassie Blue

  Coomassie blue는 SDS-PAGE 시 단백질을 staining 하기 위해 사용되는 용액으로, 0.5~40㎍의 적은 단백질도 감지할 수 있다. 본 실험에서는 Coomassie blue G-250을 이용하여 dye 하였으며, 이는 polyacrylamide gel을 가장 빠르고 편리하게 염색할 수 있도록 한다.

• 5. 실험 결과 분석

  실험 결과, NaCl의 농도가 높을수록 50~70kDa 범위의 band가 진해지는 것을 확인하였다. 이는 이론적으로 NaCl의 농도가 높을수록 AP가 더 많이 elution 되기 때문이다. 또한 정제 전보다 정제 후 AP의 순도가 높아졌음을 확인할 수 있었다. 그러나 정제하고자 하는 단백질 외의 band도 존재하였는데, 이는 AP 외에도 DEAE+와 binding한 단백질이 함께 elution 되었기 때문으로 보인다.

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• 1. SDS의 역할 및 SDS-PAGE 원리

  SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)는 단백질 변성제로 사용되며, SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)는 단백질 분자량 분석에 널리 사용되는 기법입니다. SDS는 단백질의 2차, 3차 구조를 파괴하여 단백질을 선형 구조로 만들고, 음전하를 부여합니다. 이를 통해 단백질의 고유한 전하량과 크기에 따라 분리되어 분자량을 확인할 수 있습니다. SDS-PAGE는 단백질 분리, 정제, 순도 확인 등 다양한 분야에서 활용되는 중요한 기술입니다.

• 2. Gel에 들어가는 시료의 역할

  Gel에 들어가는 시료는 SDS-PAGE 실험에서 매우 중요한 역할을 합니다. 시료에는 단백질 샘플, SDS, 환원제(예: β-mercaptoethanol), 글리세롤, 트래킹 염료 등이 포함됩니다. SDS는 단백질을 변성시켜 일정한 음전하를 부여하고, 환원제는 단백질의 이황화 결합을 끊어 선형 구조로 만듭니다. 글리세롤은 시료의 밀도를 높여 gel 내에서 침강되도록 하며, 트래킹 염료는 전기영동 과정을 모니터링할 수 있게 합니다. 이러한 시료 구성 요소들은 단백질의 효과적인 분리와 분석을 위해 필수적입니다.

• 3. Resolving Gel과 Stacking Gel의 차이

  SDS-PAGE에서 Resolving Gel과 Stacking Gel은 서로 다른 역할을 합니다. Resolving Gel은 실제 단백질 분리가 일어나는 부분으로, 높은 농도의 acrylamide를 포함하고 있어 단백질 분자량에 따른 분리가 잘 이루어집니다. 반면 Stacking Gel은 낮은 농도의 acrylamide로 구성되어 있어, 시료가 모여 좁은 띠를 형성하도록 합니다. 이를 통해 시료가 Resolving Gel로 균일하게 진입할 수 있어 분리 효율이 높아집니다. Resolving Gel과 Stacking Gel의 조성 및 pH 차이로 인해 단백질이 효과적으로 분리될 수 있습니다.

• 4. Coomassie Blue

  Coomassie Blue는 SDS-PAGE에서 단백질을 염색하는 데 널리 사용되는 염료입니다. Coomassie Blue는 단백질과 결합하여 푸른색을 띠게 되며, 이를 통해 gel 상에서 단백질 밴드를 확인할 수 있습니다. Coomassie Blue는 비교적 저렴하고 민감도가 높아 단백질 분석에 유용합니다. 또한 Coomassie Blue 염색 후 탈색 과정을 거치면 단백질 밴드의 농도를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 Coomassie Blue는 SDS-PAGE에서 가장 일반적으로 사용되는 단백질 염색 방법 중 하나입니다.

• 5. 실험 결과 분석

  SDS-PAGE 실험 결과 분석은 단백질 연구에서 매우 중요한 단계입니다. 실험 결과를 통해 단백질의 분자량, 순도, 발현 정도 등을 확인할 수 있습니다. 단백질 밴드의 위치와 강도를 분석하여 목표 단백질의 존재 여부와 양을 확인할 수 있습니다. 또한 예상되는 단백질 크기와 실제 관찰된 크기를 비교하여 단백질의 변형 여부도 확인할 수 있습니다. 이러한 분석을 통해 단백질 정제, 발현 최적화, 구조 변화 등 후속 실험을 계획할 수 있습니다. 따라서 SDS-PAGE 실험 결과에 대한 체계적이고 심도 있는 분석은 단백질 연구에서 필수적입니다.