[약대 실습 레포트] 면역학 실습 레포트_Hybridoma cell & antibody purification

문서 내 토픽

• 1. Hybridoma cell

  Hybridoma cell은 항체를 생산하는 B 림프구와 myeloma cell을 융합하여 얻은 세포로, 단일클론항체를 생산하는 세포주입니다. 이 세포주는 한 종류의 항체를 생산하는 능력과 반영구적으로 세포를 증식하는 능력을 동시에 갖고 있습니다.

• 2. Antibody purification

  Antibody purification의 원리는 Protein A나 G와 항체의 Fc region의 친화력을 이용하여 affinity chromatography를 시행하여 항체를 분리하는 것입니다. 이때 pH를 산성으로 변화시키면 단백질의 변성으로 항체와 resin 사이의 결합력이 감소하여 항체를 분리할 수 있습니다.

• 3. HAT medium

  HAT medium은 Hypoxathine, aminopterin, thymidine을 포함하는 세포 배양용 선택배지입니다. DNA 합성의 재료가 되는 뉴클레오타이드를 만드는데 세포 내 신생경로와 재생경로가 있는데, aminopterin은 신생경로를 저해하기 때문에 배지에 포함되며, 세포는 재생경로에 의해서만 뉴클레오타이드를 합성할 수 있기 때문에 재생경로에 사용되는 효소인 HGPRT, TK가 결핍된 효소는 증식할 수 없어 사멸하게 됩니다.

• 4. 마우스 면역

  마우스를 면역시키는 과정은 다음과 같습니다. ① 항원을 PBS로 희석하여 CFA와 1:1로 섞어서 쥐의 복강 내에 주입한다. ② 2주 후 같은 요령으로 면역을 시킨다. 이때는 IFA를 사용한다. ③ ELISA 결과 항체가 많이 생성되었다고 판단되면 면역시키고 2주 후에 마지막으로 항원이 섞인 PBS를 꼬리 정맥에 주사한다. ④ Last boosting 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 ELISA로 항체의 역가를 결정한다.

• 5. 세포 융합

  세포 융합 과정은 다음과 같습니다. ① 면역시킨 쥐를 마취시켜 심장에서 채혈을 한다. ② 비장을 떼어 비장세포를 분리한다. ③ 1x107개의 골수종세포와 1x108 비장세포를 50mL 튜브로 옮겨서 섞어준 후PEG(polyethylene glycol)를 이용하여 융합시킨다. ④ 세포를 RPMI1640배지로 세척한 후 HAT배지로 옮긴 후 37°C에서 키우면서 세포를 selection 한다.

• 6. 하이브리도마 제조

  하이브리도마 제조 과정은 다음과 같습니다. ① 골수세포종 준비 ② 골수종세포(SP2/0-Ag14, HGPRT 결손 세포)를 RPMI1640에서 배양한다. ③ 여러 차례 서브클로닝 했을 경우에는 50% 8-Azaguanine을 처리한다. ④ Sp2/0 세포는 8-Azaguanine에 저항성이 있으므로 HGPRT 결손 세포만 살아남는다.

• 7. 하이브리도마 배양

  하이브리도마 배양 과정은 다음과 같습니다. ① Hybridoma cell을 175T culture flask에 10% FBS DMEM 배지로 키운다. ② 2주간 배양한다. ③ Cell culture한 것을 tube로 옮긴 후 centrifuge하여 harvest한다. ④ 상층액을 0.22μm cellulose acetate membrane에 filtering하여 sample solution을 준비한다.

• 8. 크로마토그래피

  크로마토그래피 과정은 다음과 같습니다. ① Resin을 column에 packing한다. ② PBS 10mL로 column을 wash한다. ③ Sample solution 25mL을 column에 흘려 넣는다. ④ PBS 10mL로 wash를 2번 한다. ⑤ Column에 0.1M sodium acetate (pH=4.5)를 10mL 흘려 넣는다. ⑥ 미리 1M Tris (pH=9.0)을 0.1mL 넣은 EP tube에 elute를 1mL 씩 받는다. ⑦ Tube를 흔들어서 거품이 많이 보이는 sample을 한 tube에 모은다. ⑧ PBS로 dialysis 한 후 sterilization하여 사용한다.

• 9. 실험 결과 해석

  실험 결과 거품이 발생한 이유는 protein으로 구성된 antibody 때문이다. 3번부터 7번 튜브까지 거품이 관찰되었고, 5번, 6번 튜브에서 다량의 거품을 확인할 수 있었다. 이를 통해 3번부터 7번 튜브까지 antibody가 존재하며, 5, 6번의 antibody농도가 높음을 예상할 수 있다.

• 10. 실험 과정 고찰

  이번 실험에서는 affinity chromatography를 이용하여 hybrid cell culture을 통해 얻은 antibody를 순수하게 분리하였다. column에는 protein A resin이 충진되어 있어 antibody의 Fc region과 결합하게 된다. 이때 pH를 산성으로 변화시키면 단백질의 변성으로 antibody와 resin 사이의 결합력이 감소하여 항체를 분리할 수 있다. 실험 시 주의할 사항은 PBS, sample, sodium acetate를 스포이트를 이용해 column에 loading 할 때 벽면을 따라 천천히 흘려 보내야 한다는 점이다.

• 11. 단일클론항체와 다클론항체의 활용

  단일클론항체는 진단테스트, 분석 및 화학적 이용, 치료 용도 등에 널리 사용된다. 다클론 항체는 제약 분야에서 Digoxin Immune Fab, Rho(D) immune globulin 등에 사용된다. Digoxin Immune Fab는 digoxin or digitoxin의 오용 혹은 과다 사용으로 인한 부작용 문제 해결을 위해 사용되며, Rho(D) immune globulin은 적아세포증이 유발될 수 있는 임신 환경에서 사용된다.

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• 1. Hybridoma cell

  Hybridoma cells are a key component in the production of monoclonal antibodies. They are created by fusing an antibody-producing B cell with an immortal myeloma cell, resulting in a cell line that can continuously produce a specific antibody. Hybridoma cells have several advantages, including their ability to produce large quantities of a single antibody, their stability, and their potential for mass production. However, the process of creating hybridoma cells can be complex and challenging, requiring careful selection and screening to identify the desired antibody-producing cell line. Additionally, the use of hybridoma cells raises ethical considerations around the use of animal-derived materials in biomedical research and production. Overall, hybridoma cells remain an important tool in the field of immunology and antibody production, but their development and application require careful consideration of both the scientific and ethical implications.

• 2. Antibody purification

  Antibody purification is a critical step in the production of monoclonal antibodies, as it ensures the purity and quality of the final product. There are several methods available for antibody purification, including affinity chromatography, ion exchange chromatography, and size exclusion chromatography. Each method has its own advantages and disadvantages, and the choice of method will depend on factors such as the type of antibody, the desired level of purity, and the scale of production. Effective antibody purification is essential for ensuring the safety and efficacy of therapeutic antibodies, as well as for enabling accurate and reliable research applications. However, the purification process can be time-consuming and resource-intensive, and there is ongoing research into developing more efficient and cost-effective purification methods. Overall, antibody purification is a crucial aspect of monoclonal antibody production and requires careful optimization to meet the needs of various applications.

• 3. HAT medium

  HAT medium is a specialized cell culture medium used in the production of hybridoma cells for monoclonal antibody generation. The acronym 'HAT' stands for hypoxanthine, aminopterin, and thymidine, which are the key components of the medium. The purpose of HAT medium is to selectively allow the growth of hybridoma cells while inhibiting the growth of non-fused myeloma cells. This is achieved by exploiting the metabolic differences between the two cell types. Myeloma cells, which are immortalized, rely on the salvage pathway for DNA synthesis, which is blocked by aminopterin in the HAT medium. In contrast, hybridoma cells, which are a fusion of B cells and myeloma cells, can utilize the de novo pathway for DNA synthesis, which is not affected by aminopterin. This selective pressure allows for the efficient isolation and expansion of the desired hybridoma cell lines. The use of HAT medium is a critical step in the hybridoma technology and is essential for the successful production of monoclonal antibodies.

• 4. 마우스 면역

  마우스 면역은 단일클론항체 생산을 위한 핵심 단계입니다. 마우스에 항원을 주입하여 항체 생산을 유도하고, 이를 통해 얻은 B 세포를 이용하여 하이브리도마 세포를 만들 수 있습니다. 마우스 면역 과정에서는 항원의 선택, 투여 방법, 투여 횟수 등 다양한 요인을 고려해야 합니다. 또한 마우스의 유전적 배경, 면역 상태, 나이 등도 항체 생산에 영향을 미칠 수 있습니다. 효과적인 마우스 면역을 위해서는 이러한 요인들을 최적화하고, 면역 반응을 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 마우스 면역은 단일클론항체 생산의 첫 단계이지만, 이 과정에서 발생할 수 있는 다양한 변수들을 잘 관리해야 합니다.

• 5. 세포 융합

  세포 융합은 하이브리도마 세포 생산을 위한 핵심 기술입니다. 이 과정에서 항체 생산 B 세포와 불멸화된 골수종 세포가 융합되어 지속적으로 단일클론항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포가 만들어집니다. 세포 융합 기술은 복잡하고 까다로운 과정이지만, 적절한 실험 설계와 최적화된 조건 설정을 통해 효율적으로 수행할 수 있습니다. 융합 효율, 융합 세포의 안정성, 항체 생산 능력 등 다양한 요인을 고려해야 하며, 엄격한 선별 과정을 거쳐 우수한 하이브리도마 세포주를 확보해야 합니다. 세포 융합 기술의 발전은 단일클론항체 생산 기술의 핵심이며, 지속적인 연구와 개선을 통해 더욱 효율적이고 신뢰성 있는 방법이 개발될 것으로 기대됩니다.

• 6. 하이브리도마 제조

  하이브리도마 세포 제조는 단일클론항체 생산의 핵심 기술입니다. 이 과정에서는 항체 생산 B 세포와 불멸화된 골수종 세포를 융합하여 지속적으로 단일클론항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 확립합니다. 하이브리도마 제조에는 세포 융합, 선별, 배양 등 다양한 기술적 요소가 포함되며, 각 단계에서 최적화된 조건 설정과 엄격한 품질 관리가 필요합니다. 또한 윤리적 고려사항, 규제 요건, 대량 생산 등 다양한 측면에서 검토되어야 합니다. 하이브리도마 제조 기술의 발전은 단일클론항체 생산 기술의 핵심이며, 지속적인 연구와 혁신을 통해 더욱 효율적이고 신뢰성 있는 방법이 개발될 것으로 기대됩니다.

• 7. 하이브리도마 배양

  하이브리도마 세포의 배양은 단일클론항체 생산을 위한 핵심 공정입니다. 이 과정에서는 선별된 하이브리도마 세포를 적절한 배지와 배양 조건에서 증식시켜 항체를 대량 생산합니다. 하이브리도마 배양에는 세포 생장 속도, 항체 생산량, 배지 조성, 배양 환경 등 다양한 요인이 고려되어야 합니다. 또한 무혈청 배지 사용, 생물반응기 도입 등 배양 기술의 발전으로 생산성과 효율성이 지속적으로 향상되고 있습니다. 하이브리도마 배양은 단일클론항체 생산의 핵심 공정이며, 이 분야의 지속적인 연구와 기술 혁신을 통해 더욱 안정적이고 경제적인 항체 생산이 가능해질 것으로 기대됩니다.

• 8. 크로마토그래피

  크로마토그래피는 단일클론항체 정제에 있어 핵심적인 기술입니다. 다양한 크로마토그래피 기법을 통해 복잡한 세포 배양액에서 순수한 항체를 분리할 수 있습니다. 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피 등의 방법이 널리 사용되며, 각각의 장단점이 있습니다. 크로마토그래피 공정은 항체의 수율, 순도, 활성 등에 큰 영향을 미치므로 최적화된 조건 설정이 중요합니다. 또한 대량 생산을 위한 연속식 크로마토그래피 시스템 개발, 새로운 크로마토그래피 매체 개발 등 지속적인 기술 혁신이 이루어지고 있습니다. 크로마토그래피는 단일클론항체 정제의 핵심 기술로, 이 분야의 발전은 항체 의약품 생산 기술 향상에 크게 기여할 것으로 기대됩니다.

• 9. 실험 결과 해석

  실험 결과 해석은 단일클론항체 개발 과정에서 매우 중요한 단계입니다. 다양한 실험 데이터를 종합적으로 분석하여 항체의 특성, 성능, 활성 등을 정확히 평가해야 합니다. 이를 위해서는 실험 방법, 데이터 분석 기법, 통계 처리 등에 대한 깊이 있는 이해가 필요합니다. 또한 실험 결과를 바탕으로 항체 개선 방향을 도출하고, 후속 실험을 설계하는 것도 중요합니다. 실험 결과 해석의 정확성과 객관성은 단일클론항체 개발의 성공 여부에 큰 영향을 미치므로, 이 분야의 전문성 향상을 위한 지속적인 노력이 필요합니다. 실험 결과 해석은 단일클론항체 개발의 핵심 단계이며, 이를 통해 보다 우수한 항체를 개발할 수 있을 것입니다.

• 10. 실험 과정 고찰

  단일클론항체 개발을 위한 실험 과정의 고찰은 매우 중요합니다. 각 실험 단계에서 발생할 수 있는 변수와 한계점을 면밀히 검토하고, 이를 개선하기 위한 방안을 모색해야 합니다. 예를 들어 마우스 면역, 세포 융합, 하이브리도마 배양, 항체 정제 등의 과정에서 발생할 수 있는 문제점을 파악하고, 실험 설계, 시약 선택, 장비 사용 등을 최적화할 필요가 있습니다. 또한 실험 결과의 재현성, 신뢰성, 효율성 등을 면밀히 검토하여 전체 실험 과정을 개선해 나가는 것이 중요합니다. 이를 통해 단일클론항체 개발 기술을 지속적으로 발전시킬 수 있을 것입니다. 실험 과정에 대한 깊이 있는 고찰은 단일클론항체 개발의 핵심 요소라고 할 수 있습니다.

• 11. 단일클론항체와 다클론항체의 활용

  단일클론항체와 다클론항체는 각각 고유한 장단점을 가지고 있어, 다양한 분야에서 활용되고 있습니다. 단일클론항체는 특정 항원에 대해 균일한 결합력과 높은 특이성을 가지고 있어, 진단, 치료, 연구 등에 널리 사용됩니다. 반면 다클론항체는 다양한 항원 결정기에 결합할 수 있어, 복잡한 항원 구조에 대한 분석이나 면역 반응 연구에 유용합니다. 최근에는 단일클론항체와 다클론항체를 결합한 하이브리드 항체 기술도 개발되고 있습니다. 이처럼 단일클론항체와 다클론항체는 각자의 장점을 활용하여 다양한 분야에서 상호보완적으로 활용되고 있으며, 이들 기술의 지속적인 발전을 통해 더욱 다양한 응용이 가능할 것으로 기대됩니다.