본문내용
1. 세균 개체수 측정
1.1. 실험 목적
1.1.1. 세균수를 측정하는 방법 알아보기
세균수를 측정하는 방법에는 페트로프-하우저 계수기(Petroff-Hausser counting chamber), 또는 hemocytometer를 이용한 현미경에 의한 세균 수 측정 방법, 건조 질량 측정법, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하는 방법, 평판계수법(도말평판법, 혼합평판법), membrane filter법 등이 있다. 세균수를 측정하는 방법들은 각각 고유한 특성과 장단점을 가지고 있다.
페트로프-하우저 계수기나 hemocytometer를 이용한 현미경 관찰 방법은 생균, 사균을 포함한 진균수를 직접 측정할 수 있으나, 균수가 너무 적으면 부정확한 단점이 있다. 건조 질량 측정법은 균체의 질량을 측정하여 간접적으로 균수를 산출하지만, 시간이 많이 소요되고 정확도가 낮다는 단점이 있다.
분광광도계를 이용한 방법은 세균 세포가 빛을 산란시키는 정도를 측정하여 세균수를 추정하는 방법으로, 빛의 산란 정도와 세균의 농도가 정비례하는 원리를 이용한다. 이 방법은 배양 중인 세균의 농도를 실시간으로 간단히 측정할 수 있다는 장점이 있다.
평판계수법은 생장능력을 지닌 생균 수만을 측정하는 기법으로, 도말평판법 또는 혼합평판법을 사용해 시료에 들어있는 미생물 수를 계수한다. 이는 간단하고 정확한 방법이지만, 한 개의 세균이 한 개의 집락을 형성한다는 가정을 전제로 한다.
마지막으로 membrane filter법은 세균을 통과시키지 않는 membrane filter로 여과하고, 그 위에 발생한 집락 수를 세어 측정하는 방법이다. 이는 적은 재료의 균수(수돗물 등)를 측정할 때 유용하게 사용된다.
이처럼 세균수를 측정하는 다양한 방법은 각각 고유한 특성과 한계점을 가지고 있으며, 연구 목적과 시료의 특성에 따라 적절한 방법을 선택하여 사용하게 된다.
1.1.2. Hemocytometer를 이용해 현미경으로 세균수 측정하기
Hemocytometer를 이용해 현미경으로 세균수 측정하기"는 세균 개체수 측정 방법 중 하나이다. Hemocytometer는 페트로프-하우저 계수기라고도 불리며, 세균 시료를 계수판에 로딩하고 현미경으로 관찰하여 세균수를 직접 세는 방법이다.
Hemocytometer는 크게 9개의 큰 사각형 영역으로 나뉘어 있으며, 각 사각형은 가로 1 mm, 세로 1 mm, 높이 0.1 mm로 되어 있다. 따라서 한 사각형의 부피는 0.1 ㎣로 10^-4 ㎖에 해당한다. 이 때 대각선 모서리의 4개 영역(A, B, C, D)의 세균 수를 세어 평균을 내면 1 ㎖ 당 세균 수를 계산할 수 있다.
구체적인 측정 과정은 다음과 같다. 먼저 시료를 일정 비율로 희석한 후 Hemocytometer의 측면 홈에 10 ㎕ 를 넣는다. 그리고 현미경으로 관찰하면서 A, B, C, D 영역의 세균 수를 세어 평균을 낸다. 이렇게 구한 평균 세균 수에 희석배율과 Hemocytometer의 부피 환산계수(10^4 ㎖^-1)를 곱하면 원액의 세균 수를 구할 수 있다.
Hemocytometer를 이용한 세균 계수법은 직접적으로 세균 수를 측정할 수 있어 정확성이 높다는 장점이 있다. 그러나 균수가 너무 적을 경우 오차가 발생할 수 있다는 단점이 있다. 따라서 적절한 희석배율을 설정하여 측정하는 것이 중요하다.
1.1.3. 분광광도계를 이용해 세균수 측정하기
분광광도계를 이용하는 방법은 미생물 세포가 빛을 산란시키는 것을 이용하는 방법이다. 세균 수가 증가하면 탁도 역시 증가하고 배지를 투과하는 빛의 양은 적어지게 된다. 이러한 원리를 이용하여 분광광도계로 세균수를 측정할 수 있다. 빛의 산란 정도는 흡광도가 낮은 범위에서 세균의 농도에 정비례한다.
실험 방법은 다음과 같다. 첫째, 대장균 배양액(A) 1㎖를 배지 1㎖에 넣는다. 둘째, 희석액(B)를 만든다. 즉, 배양액(A) 1㎖를 10㎖의 배지에 넣어 10배 희석한다. 셋째, 희석액(B) 1㎖를 다시 배지 1㎖에 넣어 희석액(C)를 만든다. 넷째, 이와 같은 방식으로 희석액(D)까지 만든다. 다섯째, spectrophotometer를 이용해서 희석액 4개와 배양액, 배지의 분광도를 측정한다. 여섯째, 배지의 분광도를 빼서 배지를 제외한 세균의 분광도를 구한다. 일곱째, 이 데이터를 이용해서 희석배율(x)과 분광도(y)의 그래프를 그리고 x, y의 방정식을 구한다. 마지막으로, 대장균의 경우 분광도가 0.2일 때, cloning forming unit의 값이 1× 10^7cfu/㎖임을 이용해서 위의 방정식의 희석 배율 얼마가 이에 해당하는지 구한다.
이를 통해 실험 결과, 희석 배율 1/16일 때 세균수는 3.5 × 10^6 cfu/㎖, 1/8일 때 7.0 × 10^6 cfu/㎖, 1/4일 때 1.4 × 10^7 cfu/㎖, 1/2일 때 2.8 × 10^7 cfu/㎖, 원액의 경우 5.6 × 10^7 cfu/㎖로 계산되었다. 이를 통해 분광광도계를 이용하여 세균 농도를 정량적으로 측정할 수 있음을 알 수 있다.
1.2. 실험 이론 및 원리
1.2.1. 실험배경
세균의 수를 측정하는 방법에는 페트로프-하우저 계수기(Petroff-Hausser counting chamber), 또는 hemocytometer를 이용한 현미경에 의한 세균 수 측정 방법, 건조 질량 측정법, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하는 방법, 평판계수법(도말평판법, 혼합평판법), membrane filter법 등이 있다. 이러한 다양한 방법이 개발된 이유는 미생물의 수를 정확하고 효율적으로 측정하는 것이 중요하기 때문이다. 미생물의 수를 정확히 측정하는 것은 미생물 배양, 유전학, 생화학, 식품 위생학, 환경 미생물학 등 다양한 분야에서 필수적이다. 따라서 실험 목적과 환경에 맞는 적절한 세균 수 측정 방법을 선택하는 것이 중요하다.
1.2.2. Hemocytometer를 이용한 세포 계수법
Hemocytometer를 이용한 세포 계수법은 현미경을 통해 직접 세균 수를 측정하는 방법이다. 이는 페트로프-하우저 계수기 또는 hemocytometer를 사용하여 세균이 포함된 시료를 관찰하고 계수하는 것이다.
Hemocytometer는 세균용 계산판으로 9개의 큰 사각형 영역으로 나뉘어 있다. 각 영역은 가로 1mm, 세로 1mm, 높이 0.1mm의 부피를 가지고 있으므로 총 부피는 0.1mm3 (10-4mL)이다. 시료를 hemocytometer의 측면 홈에 로딩하면 모세관 현상으로 고르게 퍼지게 된다. 이후 현미경으로 관찰하며 대각선 모서리의 4개 영역(A, B, C, D)에 있는 세균 수를 세어 평균을 구한다.
세균 수를 계산하는 공식은 다음과 같다. 평균 세균 수 × (10^4mL-1) × 희석배수 = 원 시료의 세균 수/mL
예를 들어 A, B, C, D 영역의 평균 세균 수가 11.75개라면, 1mL 당 세균 수는 11.75 × 10^4 = 1.175 × 10^6개가 된다. 만약 원 시료가 10배 희석되었다면 최종 세균 수는 1.175 × 10^7개/mL이 된다.
Hemocytometer를 이용한 세균 수 측정법은 직접 세균 수를 계수하기 때문에 비교적 정확한 결과를 얻을 수 있다. 그러나 세균 수가 매우 적은 경우 부정확할 수 있다는 단점이 있다.
1.2.3. 건조 질량 측정법
건조 질량 측정법은 액체 배지에서 자란 세균을 원심분리하여 세척한 다음 오븐에서 말려 질량을 측정하는 방법이다. 이는 곰팡이의 성장을 측정하는데 특히 효과적이다.
이 방법은 시간이 많이 걸리고 정확성이 다소 떨어진다는 단점이 있다. 세균을 원심분리로 분리한 후 오븐에서 건조시켜야 하므로 처리 과정이 복잡하고 시간이 오래 소요된다. 또한 세척이나 건조 과정에서 세균 손실이 발생할 수 있어 실제 세균 수와 차이가 날 수 있다.
그러나 곰팡이와 같이 배지에 잘 퍼지지 않는 미생물의 경우 이 방법이 다른 방법에 비해 정확할 수 있다. 배지에 잘 퍼지지 않는 미생물은 다른 방법으로 세균 수를 정확히 측정하기 어려울 수 있기 때문이다.
따라서 건조 질량 측정법은 시간이 오래 걸리고 정확성이 다소 떨어지지만, 곰팡이와 같은 특정 미생물의 성장을 측정하는데 적합한 방법이라고 할 수 있다.
1.2.4. 분광광도계를 이용하는 방법
분광광도계를 이용하는 방법은 미생물 세포가 빛을 산란시키는 정도를 이용하는 방법이다. 미생물 세포수가 증가하면 탁도 또한 증가하고, 배지를 투과하는 빛의 양은 감소한다. 이 원리를 이용하여 분광광도계로 탁도를 측정함으로써 미생물의 농도를 간접적으로 측정할 수 있다.
분광광도계를 이용한 탁도 측정 방법은 다음과 같다. 먼저 순수한 배지를 이용하여 blank를 측정한다. 그 다음 미생물 배양액을 일정량 취해 분광광도계로 흡광도를 측정한다. 이때 측정 파장은 일반적으로 600nm를 사용한다. 미생물 세포가 빛을 산란시키는 정도는 흡광도가 낮은 범위에서 세균의 농도에 정비례한다. 따라서 측정된 흡광도 값을 통해 미생물 농도를 간접적으로 계산할 수 있다.
분광광도계를 이용한 세균수 측정법의 장점은 신속하고 간단하게 측정할 수 있다는 것이다. 또한 시료를 희석할 필요가 없어 번거로움이 적다. 하지만 이 방법은 생균수만을 측정하는 것이 아니라 생균과 사균을 모두 포함한 총 세균수를 측정한다는 단점이 있다. 따라서 생균수만을 측정하고자 할 경우에는 다른 방법을 병행할 필요가 있다.
1.2.5. 평판계수법
평판계수법은 생장능력을 지닌 생균 수만을 측정하는 기법이다. 시료 내 미생물이 고체한천배지 표면에서 특징적인 집락을 형성하는 것을 이용하여 세균 수를 측정한다. 이는 한 개의 세균이 한 개의 집락을 만든다는 가정 아래 세균 수를 측정하는 방법이며, 간단하고 정확하다.
평판계수법에는 도말평판법과 혼합평판법이 있다. 도말평판법은 시료를 고체배지 표면에 직접 도말하여 집락을 형성하게 한 뒤 계수하는 방법이다. 혼합평판법은 시료를 액체배지에 희석한 후, 이를 고체배지와 혼합하여 집락을 형성하게 한 뒤 계수하는 방법이다. 두 방법 모두 시료에 들어있는 미생물 수를 측정할 수 있다.
평판계수법은 다른 방법에 비해 간단하고 비용이 적게 들며, 생균 수만을 정확하게 측정할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 시료 내 미생물 수가 너무 적거나 너무 많은 경우 집락 형성이 어려워 부정확한 결과를 얻을 수 있다는 단점이 있다.
따라서 평판계수법은 시료 내 미생물 수를 정량적으로 측정하는 데 효과적인 방법이지만, 시료 농도에 따른 적절한 희석배수 선정이 중요하다고 할 수 있다.
1.2.6. membrane filter법
membrane filter법은 작은 재료의 균수(수돗물)를 측정할 때 사용하는 방법이다. 이 방법은 세균을 통과시키지 않는 membrane filter로 세균을 여과시켜 그것을 한천배지에 배양한 후 membrane filter 위에 발생한 집락 수를 세어 측정하는 방법이다.
membrane filter법의 과정은 다음과 같다. 먼저 세균을 함유한 시료를 membrane filter로 여과한다. 이때 세균은 membrane filter에 걸리게 된다. 그 다음 membrane filter를 한천배지에 옮겨 배양하면 membrane filter 위에 집락이 형성된다. 이렇게 형성된 집락 수를 세어 원래 시료의 세균 수를 계산할 수 있다. 이 방법은 적은 재료의 균수(수돗물)를 측정할 때 유용하게 사용된다.
membrane filter법의 장점은 균수가 적더라도 정량이 가능하다는 것이다. 또한 순수 배양이 필요 없으며 간단하고 신속하게 세균 수를 측정할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 membrane filter에 균이 고르게 분포하지 않을 수 있어 정량상의 오차가 발생할 수 있다는 단점도 있다.
종합적으로 membrane filter법은 적은 양의 시료에서 세균 수를 측정할 때 유용하게 사용될 수 있는 방법이다. 간단하고 신속하게 세균 수를 측정할 수 있어 실험실에서 자주 활용되고 있다.
1.3. 실험 기구 및 시약
1.3.1. 실험 재료
'1.3.1. 실험 재료'에 대한 내용은 다음과 같다.
실험 재료에는 혈구계, 커버글라스, 스포이드, 미생물 배양액, 배지, 15㎖ 튜브, 분광 광도계 등이 포함된다. 혈구계는 세균을 계수할 때 사용되며, 커버글라스는 혈구계에 시료를 올려놓을 때 사용한다. 스포이드는 배양액을 옮기는 데 사용되며, 미생물 배양액과 배지는 세균 배양에 필요한 재료이다. 15㎖ 튜브는 희석액을 만드는 데 사용되고, 분광광도계는 세균 수를 측정하는 데 이용된다. 이와 같은 다양한 실험 재료들이 세균 개체수를 측정하는 데 사용된다.
1.4. 실험 방법
1.4.1. 혈구계를 이용해 세균수 측정하기
혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세균 개체수를 측정하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 물 9㎖에 박테리아 현탁액 1㎖를 넣어 10배 희석한다. 이어서 이 희석액을 다시 물 9900㎕에 100㎕를 넣어 100배 더 희석한다. 최종적으로 100배 희석된 희석액을 혈구계에 로딩하고, 현미경을 통해 관찰한다.
혈구계는 크게 9개의 사각형 영역으로 나뉘어 있으며, 이 중 대각선 모서리에 있는 4개 영역(A, B, C, D)의 세균 수를 센다. 각 영역의 작은 사각형에서 'ㄴ' 모양으로 세면서 세균 수를 파악한다. 이렇게 세어 A, B, C, D 영역의 세균 수 평균을 구한다.
한 영역의 부피는 10^-4㎖이므로, 평균 세균 수에 10^4를 곱하면 1㎖ 당 세균 수를 알 수 있다. 또한 원액의 세균 수를 구하기 위해서는 희석배율인 1000을 곱해야 한다. 따라서 최종적으로 구한 세균 수에 10을 곱하면 원액 10㎖의 총 세균 수를 얻을 수 있다.
이처럼 혈구계를 이용하여 세균 개체수를 측정하는 방법은 현미경으로 직접 세균을 관찰하고 계수함으로써 정확한 세균 수를 파악할 수 있는 장점이 있다. 다만 균 수가 너무 적어 부정확할 수 있다는 단점이 있다.
1.4.2. 분광광도계로 세균수 측정하기 및 알려진 데이터를 이용해서 세균수 예상하기
분광광도계로 세균수 측정하기 및 알려진 데이터를 이용해서 세균수 예상하기는 다음과 같다.
분광광도계를 이용해 세균수를 측정하는 방법은 미생물 세포가 빛을 산란시키는 것을 활용한다. 세균 수가 증가하면 탁도 역시 증가하고 배지를 투과하는 빛의 양은 줄어든다. 따라서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하면 세균 수를 확인할 수 있다. 빛의 산란 정도는 흡광도가 낮은 범위에서 세균의 농도에 정비례한다.
이를 위해 먼저 대장균 배양액 1mL을 배지 1mL에 넣고, 스포이드로 잘 섞어준다. 그리고 이 희석액 1mL를 다시 배지 1mL에 넣어 희석 배율이 1/2, 1/4, 1/8, 1/16이 되도록 만든다. 각 희석액의 흡광도를 분광광도계...
