본문내용
1. 단백질 추출 및 정량
1.1. 실험 목적
이 실험의 목적은 세포에서 단백질을 추출하고 Bradford assay를 통해 이를 정량적으로 측정하는 것이다. 단백질은 생명체를 구성하는 기본 물질로, 그 존재와 양을 확인하는 것은 생화학적으로 매우 중요하다. 따라서 이 실험을 통해 생체 내에 존재하는 단백질의 양을 확인하고 정량할 수 있게 된다.
1.2. 실험 이론 및 원리
1.2.1. BSA(Bovine Serum Albumin)
BSA(Bovine Serum Albumin)는 소 혈청으로부터 분리된 알부민이다. 알부민은 생체세포나 체액 중에 널리 분포되어 있는 수용성 단백질로, 혈장 알부민은 혈장의 글로불린과 함께 혈장의 기초물질을 구성한다. BSA는 정확한 농도가 알려져 있어 단백질 정량의 표준물질로 사용되며, 단백질 안정제로도 이용된다. 알부민은 다양한 생화학적 반응에 효과적으로 작용할 수 있는 단백질 특성을 지니고 있다. 이를 통해 실험 시 단백질의 생물학적 활성을 보장하고 비특이적인 상호작용을 최소화할 수 있다. 또한 BSA는 넓은 범위의 온도에서 단백질 정량이 가능하며, 생화학적 반응에 대한 영향을 줄여주어 단백질 정량 실험에 적합한 표준물질로 활용된다.
1.2.2. Bradford method
Bradford method는 발색 반응이 빠르게 완료되고 높은 감도를 가지고 있는 단백질 정량 방법이다. 이 방법에서는 sample에 들어있는 단백질의 총량을 알 수 있다. Bradford method에서 사용되는 Coomassie Brilliant Blue G-250는 산성 조건 하에서 갈색을 띠고 있지만, 단백질과 결합하면 전체적으로 음전하를 띠며 푸른색으로 변하게 된다. 단백질 농도가 높을수록 더욱 진한 파란색을 띠게 된다.
Coomassie Blue가 단백질에 전자를 주어 단백질의 중성 상태를 무너뜨리면 단백질의 소수성 부위가 노출되는데, 이 노출된 부분에 Coomassie Blue가 비공유 결합을 이루게 된다. 또한 양전하를 띠는 아민기는 Coomassie Blue의 음전하 부위와 가깝게 위치를 조정하게 되고, 이 부분에서의 이온결합은 Coomassie Blue와 단백질 사이의 결합을 강화시켜 안정한 푸른색 형태를 만들어낸다.
Bradford method는 계면활성제, 강알칼리 등에 의해 영향을 받을 수 있으므로 주의해야 하며, 단백질마다 dye 결합 정도가 다르기 때문에 정량 시 주의가 필요하다. 또한 석영 큐벳과 반응할 수 있으므로 흡광도 측정 시 유리나 플라스틱 큐벳을 사용해야 한다.
1.2.3. Coomassie Brilliant Blue G-250
Coomassie Brilliant Blue G-250은 Bradford method에서 사용되는 염료이다. 이 염료는 산성 조건에서 갈색을 띠지만 단백질과 결합하면 전체적으로 음전하를 갖게 되어 푸른색으로 변화한다. 단백질 농도가 높을수록 더욱 진한 파란색을 나타낸다.
Coomassie Blue가 단백질에 전자를 주어 중성 상태를 무너뜨리면 단백질의 소수성 부위가 노출된다. 노출된 부분에 Coomassie Blue가 비공유 결합을 이루며, 양전하를 띠는 아민기는 Coomassie Blue의 음전하 부위와 가까이 위치하게 된다. 이 부분에서의 이온 결합은 Coomassie Blue와 단백질 사이의 결합을 강화시켜 푸른색을 띠는 형태를 더욱 안정화시킨다. 이러한 메커니즘을 통해 Bradford method에서 단백질 농도에 따른 발색 반응이 나타나게 된다.
1.3. 실험 기구 및 시약
'1.3. 실험 기구 및 시약'에 대한 내용은 다음과 같다.
실험에 사용된 기구 및 시약은 Tris-Triton lysis buffer, Protease inhibitor Cocktail, Sample buffer, BSA, Bradford Reagent, 96 well plate, microplate reader 등이다. Tris-Triton lysis buffer는 단백질 추출을 위해 사용되는 용액으로, 10 mM Tris (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10% Glycerol, 0.1% SDS 등으로 구성되어 있다. Protease inhibitor Cocktail은 단백질 분해 효소의 작용을 억제하여 단백질을 안정화시키는 데 사용된다. 표준물질인 BSA (Bovine Serum Albumin)는 단백질 정량을 위한 기준 물질로 사용되며, Bradford Reagent는 단백질 정량 실험에 사용되는 염료이다. 96 well plate와 microplate reader는 각각 단백질 시료를 담고 흡광도를 측정하는 데 사용된다.
1.4. 실험 방법
1.4.1. Tris-Triton lysis buffer 조성
Tris-Triton lysis buffer 조성은 다음과 같다"":
10 mM Tris (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10% Glycerol, 0.1% SDS로 구성되어 있다.
이 buffer는 단백질을 추출하는 데 사용되는데, Tris는 완충제 역할을 하며 pH를 7.4로 유지한다. NaCl은 삼투압을 조절하고, EDTA와 EGTA는 금속 이온 킬레이터 역할을 하여 단백질 분해 효소의 활성을 억제한다. Triton X-100은 비이온성 계면활성제로서 세포막을 용해시켜 세포 내부의 단백질을 추출할 수 있게 해준다. Glycerol은 단백질의 변성을 방지하며, SDS는 음이온성 계면활성제로서 단백질을 변성시켜 효과적인 추출을 돕는다.
1.4.2. 단백질 추출 및 정량
세포나 조직으로부터 단백질을 추출하고 이를 정량적으로 측정하는 것은 생화학 실험에서 매우 중요한 과정이다. 본문에서는 단백질 추출과 정량을 위한 실험 방법을 자세히 설명하고 있다.
먼저 세포나 조직에서 단백질을 추출하기 위해서는 Tris-Triton lysis buffer를 사용한다. 이 버퍼에는 단백질을 용해시키는 이온 성분과 비이온성 계면활성제인 Triton X-100이 포함되어 있어 세포막을 효과적으로 깨뜨릴 수 있다. 또한 glycerol과 EDTA, EGTA 등이 첨가되어 단백질의 변성을 방지한다. 추출한 세포 lysate를 원심분리하여 상층액만을 취하면 단백질을 분리할 수 있다.
분리한 단백질을 정량하기 위해서는 Bradford assay 방법을 사용한다. Bradford assay는 단백질과 Coomassie Brilliant Blue G-250 염료가 결합하면 푸른색을 띠는 원리를 이용한다. 단백질...
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