본문내용
1. 세포 배양
1.1. 실험 목적
세포 배양을 통하여 세포의 성장 주기와 세포배양법을 익히는 것이 실험 목적이다. 또한 Hemocytometer를 이용하여 세포 수를 계산할 수 있다."세포배양은 동물이나 식물로부터 체취한 세포를 인위적으로 증식시키는 것을 말한다. 세포배양에 있어 가장 중요한 것은 배양액인데 본실험에서는 DMEM이 배양액이었는데 이는 세포가 필요로하는 모든 영양물질을 공급하는 역할을 하는 물질이다. 세포배양에는 특수한 용기, 온도, 습도, 영양소 등의 배양 조건이 필요하며, 계대배양은 제한된 배양접시 내에서 세포가 증식을 멈추게 되므로 이를 막고 세포가 증식할 수 있게끔 새로운 공간을 제공하는 방법이다. 따라서 본 실험에서는 세포배양을 통해 세포의 성장 주기와 배양 기술을 익히고, Hemocytometer를 이용하여 세포 수를 계산하는 기술을 습득하는 것이 주된 목적이다."
1.2. 실험 이론 및 원리
1.2.1. 세포 배양
세포 배양이란 다세포 생물에서 분리한 세포를 특수한 용기 내에서 성장 및 보존하여 세포의 세대를 보전시키는 것을 말한다. 특수한 용기, 온도, 습도, 영양소 등의 배양 조건이 필요하다. 세포 배양은 생명현상을 해명하기 위하여 세포, 조직을 독립된 생명체로 인식하고 이들을 연구재료로 이용하는 기술로, 주로 생물공학과 의학 분야에서 활용된다.
세포를 효과적으로 배양하기 위해서는 세포의 성장과 증식에 필요한 최적의 배양 조건을 만들어야 한다. 세포 배양에서는 세포의 부착, 성장, 분열, 대사 등 다양한 생리적 특성이 고려된다. 대부분의 동물 세포는 특수한 배양 접시 바닥에 부착하여 단층을 형성하며 증식한다. 이러한 세포 증식이 일정 수준에 이르면 더 이상 증식하지 않게 되므로, 새로운 배양 접시로 옮겨 배양하는 계대 배양이 필요하다.
계대 배양이란 세포를 새로운 배양 용기에 옮겨 세포의 대를 계속해서 이어나가는 기술이다. 이를 통해 세포가 한정된 배양 접시 내에서 증식을 멈추지 않도록 하고, 세포를 지속적으로 증식시킬 수 있다. 이러한 계대 배양은 세포주를 안정적으로 유지하고 확보하는 데 필수적이다. 일반적으로 대부분의 세포는 무한정 계대 배양할 수 있는 것은 아니며, 어느 시점 이후에는 세포의 노화로 인해 더 이상 증식하지 않게 된다. 하지만 일부 암세포와 같은 특수한 세포주는 무한정 증식할 수 있다.
따라서 세포 배양은 동물 세포의 생리학적 특성을 고려하여 최적의 조건을 제공함으로써 세포를 효과적으로 증식시키고 유지하는 기술이라고 할 수 있다.
1.2.2. 계대 배양
계대 배양은 세포증식을 위해 새로운 배양접시에 옮겨 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법이다. 제한된 배양접시 내에서 세포가 증식을 멈추게 되므로 이를 막고 세포가 계속해서 증식할 수 있도록 새로운 공간을 제공하는 것이다. 즉, 세포 증식을 위한 좋은 환경을 만들어주기 위해 새로운 배양접시로 옮겨 계속해서 배양하는 것이다.
동물 세포는 미생물에 비해 환경적응력이 떨어지기 때문에 매우 까다로운 배양 조건을 필요로 하며, 배양환경이 바뀌면 쉽게 영향을 받는다. 따라서 세포가 증식을 멈추게 되면 새로운 배양접시로 옮기는 계대 배양을 통해 세포의 생존과 증식을 지속할 수 있다.
전체적인 배양환경이 변화하지 않도록 주의를 기울여야 하며, 새로운 배양접시로 옮길 때는 세포와 배양액을 골고루 섞어 세포가 균일하게 분포되도록 하는 것이 중요하다. 또한 세포의 상태를 지속적으로 관찰하고 세포수를 정기적으로 측정하여 적절한 시기에 계대 배양을 진행해야 한다. 이를 통해 동물 세포의 생존과 증식을 유지할 수 있다.
1.3. 세포 배양의 필요조건
1.3.1. 수분 조절
수분 조절은 세포 배양에 있어 매우 중요한 요소이다. 원하는 유효미생물을 왕성히 번식시키기 위해서는 미생물을 배양시키고자 하는 모든 재료의 수분 함량을 70%로 맞춰야 한다. 수분이 70% 이상으로 많을 때는 유효균보다 유해균의 번식이 많아지며, 수분이 70% 이하일 때는 유효균이나 유해균이 제대로 증식이 될 수가 없다. 따라서 세포 배양 시에는 배양액의 수분 함량을 최적의 상태인 70%로 유지하는 것이 중요하다. 수분 조절을 통해 유효한 세포의 증식과 성장을 도모할 수 있으며, 유해균의 번식을 막아 세포 배양의 성공률을 높일 수 있다. 이처럼 수분 조절은 세포 배양의 필수적인 요소로, 배양액의 수분 함량을 적절히 유지해야 세포가 건강하게 자랄 수 있다.
1.3.2. 공기의 유통
대부분의 균과 세포는 호기성으로 공기가 잘 통하게 해야 번식이 왕성하게 된다. 실험을 할 때 재료의 배합비율을 맞추어 공기구멍을 내주는 식으로 한다. 즉, 세포 배양에 필요한 공기의 유통은 세포의 번식과 증식에 매우 중요한 역할을 한다""동물세포는 미생물에 비해 환경적응력이 떨어지기 때문에 많은 조건을 충족시켜 주어야 한다. 세포 배양에 있어 공기의 유통은 호기성 세포를 배양하기 위해 필수적이다. 공기의 원활한 유통이 이루어지지 않으면 세포의 증식이 활발하게 이루어질 수 없다""
1.3.3. 온도
유효미생물은 40℃이상의 고온에서 번식을 활발히 하는 고온균이고 40℃이하의 온도에서 많이 활동하는 유해미생물은 저온균으로써 40℃이상의 높은 온도를 유지할 필요가 있다. 세포 배양 시 적정온도 유지는 매우 중요하다. 대부분의 동물 세포에 적합한 온도는 37-38°C이다. 이러한 온도는 세포가 정상적으로 생육하고 증식하는데 최적의 조건을 제공한다. 온도가 이 범위를 벗어나게 되면 세포 성장이 저하되거나 세포가 사멸할 수 있다. 예를 들어 온도가 35°C 이하로 내려가면 세포 증식이 현저히 감소하고, 40°C 이상으로 높아지면 세포는 열 스트레스를 받아 사멸하게 된다. 따라서 세포 배양 시 정확한 온도 유지를 위해 CO2 배양기를 사용한다. CO2 배양기는 세포에 적합한 온도와 습도, CO2 농도를 유지할 수 있어 세포 생존과 증식에 최적화된 환경을 제공한다. 이처럼 온도 조절은 동물 세포 배양에 있어 필수적인 요건이다.
1.3.4. 양분 공급
양분 공급은 세포 배양의 필수적인 조건 중 하나이다. 미생물이나 세포들은 자신들의 생장을 위해 다양한 영양분을 필요로 하는데, 이러한 영양분은 배양액에 포함되어 있어야 한다. 배양액에는 주로 탄소원, 질소원, 인, 황, 칼륨, 나트륨, 마그네슘 등의 무기물과 아미노산, 비타민, 지질 등의 유기물이 포함되어 있다.
탄소원으로는 포도당이 가장 널리 사용되며, 에너지원으로 이용된다. 질소원으로는 아미노산이 주로 사용되어 단백질 합성에 이용된다. 인은 핵산 합성에, 황은 아미노산 및 단백질 합성에 필요하다. 그 외에도 다양한 무기 이온들이 세포 내 삼투압 조절, 효소 활성 등의 기능을 수행한다. 유기물인 아미노산, 비타민, 지질 등은 세포 내 대사 과정에 필수적인 cofactor나 구성 성분으로 작용한다.
배양액의 조성은 배양하고자 하는 세포의 종류에 따라 달라지는데, 일반적으로 사용되는 대표적인 배지로는 DMEM, RPMI 1640, Ham's F12 등이 있다. 이들 배지는 각각 다른 아미노산, 비타민, 무기염 등의 조성을 가지고 있어 특정 세포주의 성장을 위해 최적화되어 있다. 또한 배양액에는 serum이라 불리는 동물 유래의 복합 단백질 혼합물이 첨가되는데, 이는 세포의 성장과 분화에 필요한 호르몬, 성장인자 등을 공급한다.
세포 배양 시 배지 내 영양분이 고갈되면 세포의 증식이 억제되고 대사 산물의 축적으로 인해 pH 변화가 일어나는 등 세포의 건강한 상태가 유지되지 않는다. 따라서 주기적으로 배지를 교환하거나 보충해줌으로써 세포에 충분한 영양분을 공급할 필요가 있다. 이를 통해 세포의 최적 성장 조건을 유지할 수 있다.
1.4. 세포의 성장 및 증식
1.4.1. 세포의 성장곡선
세포의 성장곡선은 미생물을 배양할 때 배양시간과 생균수의 대수(log) 사이의 관계를 나타내는 곡선이다. 이 곡선은 크게 5개의 구간으로 나눌 수 있는데, 유도기, 증식기, 안정기, 사멸기가 그것이다.
유도기는 균을 새로운 배지에 접종하여 배양할 때 배지에 적응하는 시기로, 세포가 새로운 화경에서 증식하는데 필요한 각종 효소단백질을 생합성하는 시기이다. 이 기간 동안에는 세포의 크기가 커지고 호흡활성도가 높아지며, 세포내의 RNA량은 현저하게 증가하고 효소 단백질 합성이 왕성해진다. 그러나 DNA량은 변화하지 않는다.
증식기는 세포질의 합성속도와 세포수가 대수적으로 증식하는 시기이다. 세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기로, 물리적 화학적 처리에 대해서 감수성이 높다. 지수생장속도는 1차반응속도와 같다.
안정기는 생균수가 일정하게 유지되고 총 균수가 최대가 되는 시기이다. 이 시기에는 일부 세포가 사멸하고 다른 일부의 세포는 증식하여 사멸수와 증식수가 거의 같고 생균수가 증가하지 않는다.
사멸기는 생균수가 감소하는 시기로, 영양분 고갈과 미생물의 대사노폐물로 인해 생육에 최고로 열악한 환경인 시기이다. 영양분이 없어진 미생물은 자가 소화를 통해 자신의 성분을 분해하여 영양분으로 사용한다.
이와 같은 세포의 성장곡선은 미생물 배양 뿐만 아니라 동물세포 배양에서도 관찰되며, 세포의 생장 및 증식 과정을 이해하는데 매우 중요한 개념이다.
1.4.2. 유도기
유도기는 균을 새로운 배지에 접종하여 배양할 때 배지에 적응하는 시기로 세포가 새로운...
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