본문내용
1. 대장균의 형질전환
1.1. 서론
대장균이 가지고 있지 않은 외부 유전자를 인위적으로 삽입하여 대장균의 본래의 형질을 전환시키는 것을 의미한다. 유전자 조작을 통해 형질 전환 시킨 대장균은 유용한 물질을 대량 생산할 수 있다. 따라서 이는 생명공학에서 매우 중요한 기술이라고 할 수 있다. 우린 이 대장균을 이용하여 형질 전환을 시키는 것이다.
1.2. 형질전환의 원리
형질전환의 원리는 다음과 같다. 세균이 다른 세균의 DNA를 받아들여 자신의 염색체에 삽입하는 것을 의미하며, 이를 통해 세균은 유전적 다양성을 확보할 수 있다.
대장균과 같은 그램 음성 세균의 형질전환에 널리 사용되는 방법은 염화칼슘(CaCl2) 처리법이다. 2가의 양이온인 CaCl2는 세포막의 유동성을 높여주고, 세포 표면의 인지질, lipopolysaccharide(LPS)의 음전하를 중화시킴으로써 음전하를 띤 DNA의 세포 표면 결합 및 통과를 촉진시킨다. 형질전환 시에 열충격을 주는 이유는 세포 구멍이나 손상된 세포벽을 통한 DNA의 세포 내로의 이동을 촉진하는 효과가 있기 때문이다.
이처럼 화학적 처리와 열충격을 통해 세균 세포막의 투과성을 높여 외래 DNA를 효과적으로 도입할 수 있다. 이러한 형질전환 기술은 유용한 물질을 대량 생산할 수 있는 방법으로 생명공학 분야에서 매우 중요하게 활용되고 있다.
1.3. 형질전환 방법
1.3.1. 화학적 처리
화학적 처리 방법은 대장균과 같은 그램 음성 세균의 형질전환에 널리 사용되는 방법이다. 이 방법은 염화칼슘(CaCl₂) 처리법으로 알려져 있다. 2가의 양이온인 칼슘 이온은 세포막의 유동성을 높여주고, 세포 표면의 인지질과 lipopolysaccharide(LPS)의 음전하를 중화시킨다. 이를 통해 음전하를 띤 DNA의 세포 표면 결합 및 통과를 촉진시키는 것으로 알려졌다.
형질전환 과정에서 염화칼슘으로 처리한 세포에 열충격을 주게 되는데, 이는 세포 구멍이나 손상된 세포벽을 통한 DNA의 세포 내로의 이동을 촉진하는 효과가 있다. CaCl₂ 이외에도 다른 물질이 사용되기도 하는데, 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 경우 lithium acetate와 polyethylene glycol을 사용한다. 한편 균사체를 형성하는 Streptomyces와 같은 미생물의 경우 효소 처리를 통해 세포벽을 제거한 후 spheroplast 형태로 만들어 형질전환을 하기도 한다.
1.3.2. 전기천공법
전기천공법은 세포에 10-20 kv/cm의 일시적인 전기충격을 가해 세포막을 불안정하게 하고 순간적인 구멍이 형성되어 이를 통해 DNA가 들어가도록 하는 방법이다. 일반적으로 화학적 방법보다 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있다. 이 방법의 원리는 다음과 같다. E.coli의 세포막의 지질은 음전하를 띠는데, DNA 역시 음전하를 띠기 때문에 반발력이 발생한다. 따라서 E.coli 세포를 2가 양이온의 존재 하에 0℃에서 배양하면 양이온이 E.coli 세포막의 음전하를 띠는 인지질과 결합하여 세포막의 전기적 성질을 변화시켜 막 구조를 불안정하게 만든다. 이때 순간적인 열을 가하면 세포막 내부와 외부의 온도 차이로 인해 DNA가 세포 안으로 빨려 들어가게 된다.
1.4. 형질도입
1.4.1. 일반 형질도입
일반 형질도입은 박테리오파지를 매개로 하여 세균 DNA가 다른 세균으로 이동되는 현상을 의미한다. 이는 일반적인 형질전환과 달리 2개의 세균이 관여한다.
일반 형질도입 과정은 다음과 같다. 먼저 숙주세균이 박테리오파지에 감염되면 숙주 세균의 염색체 DNA가 박테리오파지 DNA와 함께 조립된다. 그 후 박테리오파지가 숙주 세균에서 방출되면서 숙주 세균의 DNA 일부가 박테리오파지 껍질에 포장된다. 이렇게 포장된 박테리오파지가 다른 세균에 감염되면 감염된 세균은 숙주 세균의 유전자를 획득하게 되어 새로운 표현형을 나타내게 된다. 즉, 박테리오파지를 매개로 하여 한 세균의 유전자가 다른 세균으로 이동하는 것이 일반 형질도입이다.
이와 같은 일반 형질도입은 자연계에서 세균들이 유전적 다양성을 획득할 수 있는 중요한 수단이 된다. 또한 실험실에서도 박테리오파지를 이용하여 특정 유전자를 다른 세균에 도입하는 데 활용될 수 있다.
1.4.2. 특이 형질도입
특이 형질도입은 박테리오파지를 이용하여 세균 DNA가 다른 세균으로 이동하는 현상을 말한다"". 일반 형질도입과 달리 박테리오파지가 숙주 세균의 DNA를 자신의 유전체에 포함시킨 다음, 그 박테리오파지가 다른 세균을 감염하면서 숙주 세균의 유전자가 다른 세균으로 전달된다"". 이러한 박테리오파지 매개 유전자 전달은 세균이 다양한 유전적 특성을 확보할 수 있는 생존 전략이다"". 특이 형질도입은 박테리오파지의 흡착, 수정체 형성, 용원형질도입 등의 단계를 거치면서 이뤄진다"". 따라서 특이 형질도입은 박테리오파지를 이용해 세균 유전자를 다른 세균으로 전달하는 기술이라고 할 수 있다"".
1.5. 접합
접합은 미생물을 주체로 한 두 개체 간의 직접적인 접촉으로 인해 수평적 유전자 교환이 이루어지는 현상을 말한다. 접합은 세균들이 유전적 다양성을 확보할 수 있는 수단으로, 유전자를 서로 교환할 수 있게 해준다. 접합이 일어나면 수여세균(recipient cell)이 공여세균(donor cell)의 유전자를 받아 자신의 유전체에 편입시키게 된다. 이는 수여세균이 새로운 형질을 갖게 되는 것을 의미한다. 접합은 특히 세균이 항생제 내성, 독소 생산 능력 등과 같은 병원성 유전자를 수평적으로 전달하는 데 중요한 역할을 한다.
1.6. 재조합 DNA의 선별지표
재조합 DNA의 선별지표는 주로 항생제 저항성 유전자가 활용된다. 재조합 DNA를 도입받은 대장균은 항생제에 내성을 가지게 되므로, 항생제가 첨가된 배지에서만 선별적으로 자랄 수 있다. 예를 들어, pUC...
