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1. 유전자 클로닝을 위한 효소들의 종류와 특징
1.1. 유전자 클로닝을 위한 효소의 종류
유전자 클로닝을 위한 효소의 종류는 다음과 같다.
뉴클레아제는 핵산 분자를 절단하거나 짧게 하는 효소이다. 엑소뉴클레아제는 DNA 분자의 말단에서 뉴클레오티드를 하나씩 제거하며, 엔도뉴클레아제는 DNA 분자 내에서 내부 포스포디에스테르 결합을 끊을 수 있다.
리가아제는 핵산 분자들을 연결해준다. 세포에서 DNA 리가제는 DNA 복제동안에 이중가닥 DNA 분자 내에서 일어나는 한가닥 파손을 복구한다.
중합효소는 분자의 복사체를 만든다. DNA 중합효소는 현존하는 DNA 혹은 RNA 주형에 대응하는 새로운 DNA 가닥을 합성하는 효소이다. DNA 중합효소 I, Klenow fragment, 역전사효소 등이 주요한 중합효소이다.
변형효소는 화학기능기를 첨가 혹은 제거한다. 알칼린 포스파타제, 폴리뉴클리오티드 키나아제, 터미날 디옥시뉴클레오티딜 트란스페라제 등이 대표적이다.
토포이소메라제는 닫혀진 공유결함형 원형 DNA에 초나선형을 도입하거나 제거한다. 토포이소메라제는 DNA복제 연구에는 중요하지만, 유전공학에 있어서는 실질적인 용도를 더 발견해야 한다.
이처럼 유전자 클로닝을 위해 다양한 종류의 효소들이 사용되며, 각 효소는 고유의 특성과 기능을 가지고 있다.
1.2. DNA를 절단하는 효소들-제한효소
DNA를 절단하는 효소들-제한효소이다. 유전자 클로닝은 DNA 분자를 아주 정확하고 재현성있는 방식으로 절단하는 것을 요구한다. 이것은 벡터가 재조합 DNA 분자의 구축 동안에 절단되는 방법에 의해 확인되어 진다. 각 벡터 분자는 원형의 분자를 절단하여 새로운 DNA가 삽입될 수 있도록 단 하나의 위치에서 절단되어져야 한다. 한 번 이상 절단된 분자는 두 개 혹은 그 이상으로 떨어진 단편으로 나누어져 클로닝 운반체로서 소용이 없게 된다. 더구나 각 벡터 분자는 정확하게 같은 위치에서 절단되어져야 한다.
정제된 제한효소는 분자 생물학자들이 정확하고 재현성있는 방식으로 DNA분자를 절단하도록 한다. 제한 효소의 우연한 발견이 된 최초의 관찰은 1950년 초에 숙주 조절 제한이라 부르는 현상, 즉, 어떤 균주의 박테리아가 박테리오파아지 감염에 면역성이 있다는 것이 보여질 때이다. 제한의 기작은 완전히 이해되는데 20년 이상이 걸렸지만, 아주 복잡하지는 않다. 파아지 DNA가 복제되어 새로운 파아지 입자를 직접 합성하기 전에 박테이아가 파아지 DNA를 절단하는 효소를 생성하기 때문에 제한이 일어난다. 물론 치명적인 파괴를 박테리아 자체 DNA는 공격으로부터 보호되는데, 이것은 절단효소의 활동을 막는 부가적인 메틸기를 가지고 있기 때문이다. 이러한 절단효소를 제한효소라고 부르며, 거의 대부분의 박테리아 종에 의해 합성되어지며, 1200개 이상의 효소가 잘 알려져 있다.
제한효소 중 form II 제한효소가 유전자 클로닝에 있어 아주 중요한 절단 효소이다. Form II 제한효소의 주요 특징은 각 효소가 DNA 분자를 절단하는 특별한 인식 염기배열을 가지고 있다는 것이다. 특별한 효소는 인식 염기배열에서 DNA를 절단하며 다른 곳은 결코 절단하지 않는다. 예를 들면 PvuI이라 부르는 제한효소는 헥사뉴클레오티드 CGATCG 에서만 DNA를 절단한다. 반면에 같은 박테리아의 두 번째 효소인 PvuII 는 다른 헥사뉴클레오티드인 CAGCTG에서만 절단한다.
많은 제한효소는 헥사뉴클레오티드 표적부위를 인식하지만 다른 것은 4개, 5개 혹은 8개 뉴클레오티드 염기배열에서 절단한다. Sau3A는 GATC를 인식하며, AluI는 AGCT에서 절단한다. Degenerate 인식 염기배열을 가진 제한 효소들도 있다. HinfI은 GANTC를 인식하여 GAATC, GATTC, GAGTC, GACTC등을 절단한다.
절단부위의 정확한 성질은 유전자 클론 실험의 고안에 있어서 상당히 중요하다. 많은 제한효소는 인식 염기배열의 가운데의 이중가닥 절단을 하며 , 그 결과로 blunt 말단이 된다. 하지만 다수의 제한효소는 약간 다른 방법으로 DNA를 절단한다. 이러한 효소는 두 개의 DNA 가닥을 정확하게 같은 지점에서 절단하지 않는다. 그 대신에 둘 혹은 네 개의 뉴클레오티드를 엇물리게 절단하여 그 결과로 DNA 단편이 각 말단에에서 짧은 단일 가닥 돌출부분을 가지게 한다. 이것은 sticky 말단이라 부르는데 이들사이의 염기쌍 형성으로 DNA를 다시 점착시킬 수 있기 때문이다.
제한효소 절단의 실험적 과정을 살펴보면...
