본문내용
1. 단백질의 분리와 분석
1.1. 전기영동을 이용한 단백질의 분리
1.1.1. 전기영동의 원리
전기영동의 원리이다. 전기영동 혹은 전기이동은 전극 사이의 전기장 하에서 용액 속의 전하가 반대 전하의 전극을 향하여 이동하는 화학현상이다. 전하가 q인 이온이 그 크기가 E인 전기장에 놓일 경우, 이온이 받는 전기력의 크기는 F=qE이다. 이온은 용액 내에서 전기력에 따른 가속 때문에 속력이 점차 증가하나, 주변 용액 때문에 전기력과 반대방향으로 마찰력을 받는다. 이때 마찰력의 크기는 이온의 속력에 비례하므로 점차 이온의 속력은 일정한 값에 수렴한다. 전기영동 현상은 주로 단백질, RNA, 그리고 DNA를 분석하는 기법에 응용된다. 일반적으로 이온은 다양한 구조를 가진 분자이므로, 마찰계수를 직접 구하기 어렵다. 따라서 양 전극의 전압을 변화시키면 전기장의 세기를 변화시킬 수 있으므로, q/f, 이동성(mobility)과 이온의 속력의 관계를 파악한다.
1.1.2. 단백질 변성과 SDS-PAGE
SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate?polyacrylamide gel electrophoresis)는 단백질의 분자량을 기준으로 분리하는 전기영동 기법이다. SDS(도데실황산나트륨)는 계면활성제로서 단백질의 삼차구조를 풀어주며, 모든 단백질 분자에 균일하게 음전하를 부여한다. 이에 따라 단백질은 전극을 통해 양극 방향으로 이동하게 되며, 분자량이 작을수록 빠르게 이동하는 성질을 갖게 된다.
SDS는 단백질 분자에 약 1.4 그램의 SDS가 결합하여 단백질의 고유 전하는 무시할 수 있게 된다. SDS-단백질 복합체는 거의 균일한 질량 대 전하 비를 갖게 되므로, 단백질의 이동 속도는 분자량에 비례하게 된다. 이를 통해 표준단백질과의 비교를 통해 미지 단백질의 분자량을 추정할 수 있다.
SDS-PAGE는 불연속적인 완충액 시스템을 이용한다. 퇴적용 겔(stacking gel)에서는 시료 내 모든 단백질 복합체를 작은 부피로 농축시킨 후, 분리용 겔(resolving gel)에서 단백질을 분자량에 따라 분리한다. 퇴적용 겔의 pH는 6.8, 분리용 겔의 pH는 8.8로 설정하는데, 이는 Glycine의 전하 상태를 조절하여 시료가 효과적으로 농축되고 분리되도록 하기 위함이다.
전기영동 과정에서 시료 내 단백질은 가열 처리를 통해 변성된다. 이는 SDS가 단백질의 삼차원 구조를 풀어 SDS-단백질 복합체를 형성하도록 하기 위함이다. 단백질이 변성되지 않으면 SDS가 내부로 침투하지 못해 단백질의 크기에 비례하는 전하를 얻을 수 없기 때문이다.
β-mercaptoethanol은 단백질의 이황화물 결합을 환원적으로 절단하여 단백질을 완전히 변성시키는 데 사용된다. Bromophenol blue는 전기영동 진행 상황을 추적하는 트래킹 dye로 사용된다. Coomassie Brilliant Blue는 단백질과 결합하여 비특이적으로 단백질을 염색하는 데 이용된다. 이 과정에서 단백질 이외의 부분은 탈색되어 단백질 밴드만 선명하게 관찰할 수 있게 된다.
종합하면, SDS-PAGE는 SDS를 통해 단백질을 변성 및 균일한 음전하를 띠게 만들어 분자량에 따라 분리하는 기법이다. 이때 불연속적인 완충액 시스템, 가열 처리, 환원제 및 트래킹 dye 등이 효과적인 분리를 위해 활용된다.
1.1.3. 불연속적인 완충액 시스템
불연속적인 완충액 시스템은 퇴적용 겔에서 시료 안의 모든 복합체들을 매우 적은 부피로 농축시켜서 분해용 겔에서 단백질의 해상도를 크게 증가시켜주는 역할을 한다. 이를 위해 lower gel과 upper gel 두 가지 겔을 이용한다.
lower gel에서는 pH 8.8의 완충용액을 사용하여 Gly의 mobility를 낮춰 단백질이 stacking되지 않고 separating될 수 있게 한다. 반면 upper gel에서는 pH 6.8의 완충용액을 사용하여 Gly의 net charge를 적절히 조절함으로써 Cl-, 단백질-SDS, Gly 간의 상대적 mobility 차이를 이용하여 단백질을 stacking시킨다. 이를 통해 분해용 gel에서 단백질의 해상도를 높일 수 있게 된다.
따라서 불연속적인 완충액 시스템은 퇴적용 겔과 분리용 겔의 pH 및 이온 강도 차이를 이용하여 단백질 시료를 농축하고 분리능을 향상시키는 데 핵심적인 역할을 한다고 볼 수 있다. 이는 SDS-PAGE 기법의 핵심적인 특징이자 장점이라고 할 수 있다.
1.2. 단백질 분석 기법
1.2.1. UV 분광법을 이용한 단백질 정량
단백질에 포함된 아미노산 중 트립토판, 티로신, 페닐알라닌은 자외선을 흡수하는 특성을 지니고 있다. 따라서 단백질 용액의 자외선 흡광도를 측정하여 단백질의 양을 정량할 수 있다. 이 때 단백질의 흡광도는 280nm 부근에서 가장 크게 나타난다. 단백질 용액의 농도와 280nm에서의 흡광도 사이에는 거의 비례관계가 성립하므로,...
