본문내용
1. 서론
1.1. Bradford 법을 이용한 단백질 농도 측정의 목적
Bradford 법을 이용한 단백질 농도 측정의 목적은 이미 농도를 알고 있는 표준 단백질 용액을 이용하여 농도를 모르는 시료의 단백질 농도를 측정할 수 있다는 것이다. 표준 단백질 용액과 미지 시료의 흡광도를 비교하여 미지 시료의 단백질 농도를 추정할 수 있다. 이를 통해 다양한 생물학적 시료에 포함된 단백질의 양을 정량적으로 분석할 수 있다.
1.2. 단백질 정량법의 개요
단백질 정량법의 개요이다. 단백질을 정량하는 대표적인 방법으로는 UV spectrophotometry, Biuret method, Lowry method, BCA assay, Bradford assay 등이 있다.
UV spectrophotometry는 단백질 내의 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp)에 의한 280nm에서의 최대 흡광을 이용하는 방법이다. 단백질의 농도에 비례하여 흡광도가 증가하므로 이를 이용하여 단백질의 농도를 정량할 수 있다. 이 방법은 빠르고 간단하며 단백질 변성이 없다는 장점이 있지만, buffer, pH, salt, 핵산 등에 영향을 받고 아미노산 조성에 따라 값이 달라진다는 단점이 있다.
Biuret method는 알칼리 조건에서 Cu2+이온이 단백질의 peptide nitrogen에 결합하여 보라색 착화합물을 형성하고, 540-560nm 파장의 흡광도를 측정하는 방법이다. 단백질의 농도에 비례하여 착화합물의 양이 증가하므로 이를 이용하여 단백질을 정량할 수 있다. Biuret method는 아미노산 조성의 차이에 영향을 받지 않는다는 장점이 있지만, 감도가 낮아 1mg 이상의 단백질 농도 측정에 적합하다.
Lowry method는 Biuret method의 원리에 Folin-Ciocalteu 반응을 추가한 방법이다. 알칼리 조건에서 Cu2+이온이 단백질의 peptide nitrogen에 결합하여 Cu+로 환원되고, 환원된 Cu+이 Folin-Ciocalteu 시약을 환원시켜 청색으로 발색하는 원리를 이용한다. Lowry method는 Biuret method에 비해 100배 높은 감도를 가지지만, 반응 시간이 느리고 화학 물질에 의한 방해를 받을 수 있다는 단점이 있다.
BCA assay는 단백질이 구리 이온(Cu2+)을 1가 이온(Cu+)으로 환원시키는 성질을 이용한다. 환원된 Cu+이 bicinchoninic acid(BCA) 분자 2개와 반응하여 보라색 착물을 형성하며, 이 착물의 562nm에서의 흡광도가 단백질 농도에 비례한다. BCA assay는 일반적인 버퍼에 의한 간섭이 적고, 계면활성제와 함께 사용할 수 있으며, 민감도가 높다는 장점이 있다.
Bradford assay는 Coomassie Brilliant Blue G-250 염색약이 단백질과 결합하면 최대 흡광 파장이 465nm에서 595nm로 변화하는 성질을 이용한다. 산성 조건에서 단백질이 Coomassie 염료와 결합하면 푸른색으로 발색되며, 595nm에서의 흡광도가 단백질 농도에 비례한다. Bradford assay는 방법이 간단하고 반응이 신속하며 감도가 높다는 장점이 있지만, 계면활성제의 영향을 받기 쉽다는 단점이 있다.
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