소개글
"Lb배지 만들기"에 대한 내용입니다.
목차
1. LB 배지 만들기
1.1. LB 배지의 정의와 특징
1.2. LB 배지의 주요 성분
1.3. LB 배지의 제조 과정
1.3.1. 액체 LB 배지 제조
1.3.2. 고체 LB 배지 제조
1.3.3. Ampicillin이 포함된 LB 배지 제조
1.4. 배지 멸균을 위한 Autoclave 사용
1.5. 고체 LB 배지의 분주 및 보관
2. E.coli의 형질전환
2.1. 형질전환의 원리와 목적
2.2. 실험 재료 및 방법
2.2.1. Competent cell 준비
2.2.2. Heat shock 방법을 통한 형질전환
2.3. 형질전환 성공 확인
2.3.1. 콜로니 관찰
2.3.2. CFU (Colony Forming Unit) 계산
3. 결론 및 고찰
3.1. 실험 결과 요약
3.2. 오차 발생 원인 분석
3.3. 향후 개선 방안
4. 부록
4.1. 형질전환 유도 방법 원리
4.1.1. Heat shock 방법
4.1.2. Electroporation
4.2. 항생제의 종류와 작용 기전
4.2.1. 세포벽 합성 억제
4.2.2. 전사과정 억제
4.2.3. 번역과정 억제
5. 참고 문헌
본문내용
1. LB 배지 만들기
1.1. LB 배지의 정의와 특징
LB 배지는 미생물, 특히 대장균(E.coli)의 배양에 널리 사용되는 배지이다. LB 배지라는 명칭은 생화학자 Luria와 Bertani의 이름에서 유래되었으며, 용원성(Lysogeny)을 연구하기 위해 고안된 배지로 알려져 있다. LB 배지는 미생물이 생장하는 데 필요한 다양한 영양 성분을 함유하고 있어, 미생물의 대량 배양, 생화학적 연구, 대사산물 생산 등 다양한 목적으로 사용된다. LB 배지는 액체와 고체 형태로 모두 제조될 수 있으며, 고체 배지의 경우 한천(agar)을 첨가하여 제조한다. LB 배지는 박테리아의 기본적인 배양과 분리, 선별을 위한 일반적인 배지로 널리 활용되고 있다.
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1.2. LB 배지의 주요 성분
LB 배지의 주요 성분은 효모로부터 추출되어 미생물이 생장하는데 필요한 여러 가지 영양물질이 함유된 효모 추출물, 우유단백질인 카세인을 분해하여 단백질 공급원이 되는 트립톤, 그리고 배양할 세포가 삼투에 의하여 터지지 않도록 해주는 염화나트륨이다. 이렇게 LB 배지는 미생물 성장에 필요한 필수적인 영양분들이 고루 포함되어 있어 박테리아의 대량 배양이나 생화학적 연구, 대사산물 연구 등에 널리 사용된다.
1.3. LB 배지의 제조 과정
1.3.1. 액체 LB 배지 제조
액체 LB 배지는 미생물 배양에 널리 사용되는 대표적인 배지이다. 이를 제조하기 위해서는 메스실린더를 이용하여 100ml의 증류수를 계량한다. 증류수 일부는 비커에 남겨두어 시료가 비커 바닥에 붙는 것을 방지한다. 정밀저울을 사용할 때는 주변 환경에 따른 영향을 최소화하기 위해 에어컨 등 바람을 일으키는 환경을 제거하고, 저울의 수평을 맞춘 뒤 사용한다. 시료들을 비커에 모두 넣은 뒤 증류수를 최종 부피까지 채운다. 시료들이 벽면에 붙어 있는 경우 증류수로 씻어내어 제거한다. 교반기를 사용하여 액체배지의 시료들을 잘 혼합시킨다. RPM 속도는 무리하게 높이지 않도록 주의하며, pH 시험지를 이용하여 pH 7 정도로 적절한 수준인지 확인한다. []
1.3.2. 고체 LB 배지 제조
Agar 성분이 추가된 고체배지(plate)를 만든다. 고체배지의 경우, 200ml를 만들 것이므로 메스실린더로 200ml 증류수를 계량한다. 메스실린더로 계량한 200ml의 증류수를 삼각플라스크에 담아주고 부피를 표시한다. 고채배지를 고형화 시키는데 가장 중요역할을 하는 Agar 3g을 계량한다. 이렇게 준비된 증류수와 Agar를 섞어 고체 LB 배지를 제조한다.
고체배지를 제조하는 과정에서 멸균 상태를 유지하기 위해, 삼각플라스크의 입구를 호일로 막고 멸균테이프를 붙인다. 그리고 Autoclave를 이용하여 121도에서 15분간 배지를 멸균한다. 멸균이 완료된 후에는 배지가 굳기 전에 petri dish에 분주한다. 알코올램프를 켜두어 열기로 이용해 공기의 흐름을 상승시켜 낙하균으로부터의 오염을 방지한다. 멸균된 고체배지를 petri dish 밑바닥에 가득 차도록 분주한다. 200ml 배지 기준으로 약 10개의 LB plate가 만들어진다.
이렇게 제조된 고체 LB 배지는 단백질과 탄수화물 등 박테리아의 성장에 필요한 성분이 풍부하며, 배지 내부의 Agar가 경화되어 고체 상태로 존재하게 된다. 이를 통해 미생물 실험에 주로 사용되며, 특히 콜로니 관찰과 분리 배양 등에 활용된다.
1.3.3. Ampicillin이 포함된 LB 배지 제조
Ampicillin 항생제가 포함된 LB 고체 배지를 제조한다. 100ml의 고체 배지를 만들기 위해, 먼저 메스실린더로 100ml의 증류수를 계량한다. 이전과 동일하게 LB 배지 조성물을 혼합하고 autoclave를 이용해 121℃에서 15분간 멸균한다. 이후 배지가 50~60℃로 식으면 Ampicillin 항생제를 첨가한다. Ampicillin은 열에 약한 구조를 가지므로 배지 멸균 시 열에 의해 변성될 수 있기 때문이다.
본 실험에서는 Ampicillin을 사용농도보다 1,000배 농축된 100mg/ml 농도로 제조하여 사용한다. 멸균된 고체 배지 100ml에 100mg/ml 농도의 Ampicillin 용액 0.1ml를 첨가하여 최종적으로 100μg/ml 농도의 Ampicillin이 포함된 LB 고체 배지를 완성한다.
고체 배지에 Ampicillin을 첨가하는 이유는 원하는 대장균 균주만 선택적으로 배양하기 위해서이다. Ampicillin 저항성 유전자를 가진 대장균만이 Ampicillin이 포함된 배지에서 생장할 수 있기 때문에, 오염 미생물의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다....
참고 자료
이종호 “의생명과학 실험서. 상권”, 국내서 단행본, 서울 : 라이프사이언스, 2021 (p.4-7)
신경옥 “(이해하기 쉬운)생화학 실험”, 국내서 단행본, 서울: 파워북, 2014 (p.126-133)
Campbell & Reece, 『생명과학』(7판), 라이프사이언스:서울, 292-293 (2006).
Srivastava & Sheela, Genetics of Bacteria, Springer-Verlag:India, 91-103 (2013).
Kamran C. Melikov et al., Voltage-Induced Nonconductive Pre-Pores and Metastable Single Pores in Unmodified Planar Lipid Bilayer. Biophysical Journal 80 (4), 1829-1836 (2001).
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