본문내용
1. Protein Extraction
1.1. Introduction
단백질 추출(Protein Extraction)은 세포 또는 조직으로부터 특정 단백질을 분리해내는 과정이다. 이는 세포 내부에 존재하는 단백질의 수준을 확인하기 위해 수행된다. 단백질 추출 과정은 세포막이나 핵막과 같은 세포 구조물을 물리적 또는 화학적으로 파괴하여 세포 내부의 단백질을 용출시키는 것이 핵심이다. 이를 통해 세포 수준에서의 단백질 변화를 관찰할 수 있다.
단백질 추출 과정은 크게 세포 용해(cell lysis) 단계와 단백질 분리 단계로 구분된다. 세포 용해 단계에서는 세포막과 같은 세포 구조물을 파괴하여 세포 내부의 물질들을 유출시킨다. 이후 원심분리 등의 방법으로 단백질을 분리하게 된다. 단백질 추출 시 사용되는 방법은 세포의 종류와 목적 단백질의 특성에 따라 선택된다. 예를 들어 식물세포의 경우 세포벽이 단단하므로 homogenizer와 같은 물리적 방법을, 동물세포의 경우 detergent와 같은 화학적 방법을 주로 사용한다. 이처럼 단백질 추출 과정은 실험의 목적과 대상 세포에 따라 적절한 방법을 선택하는 것이 중요하다.
단백질 추출 과정에서 주의해야 할 점은 단백질의 변성을 최소화하는 것이다. 단백질은 온도, pH, 화학물질 등에 매우 민감하므로 이들 요인에 의해 변성이 일어나면 단백질의 구조와 기능이 손실될 수 있다. 따라서 단백질 추출 시에는 저온 조건을 유지하고, pH 변화가 적은 완충액을 사용하며, 단백질 분해효소와 인산화효소의 작용을 억제하기 위한 저해제를 첨가하는 등의 주의가 필요하다.
1.2. Protein Extraction Purpose
단백질 추출의 목적은 세포(또는 조직)로부터 특정 단백질을 추출하여 단백질 수준에서의 변화를 확인하기 위함이다. lysis buffer를 이용해 세포(막)을 분해하여 세포 내에 있는 단백질을 추출함으로써, 실험 sample에 대한 단백질 발현 양상의 변화를 분석할 수 있다. 이를 통해 세포 내 단백질의 기능, 상호작용, 조절 메커니즘 등을 규명하고 질병 진단 및 치료 표적 발굴에 활용할 수 있다.
1.3. Protein Extraction Principle
cell를 lysis하고 얻은 homogenizer(균질액)는 밀도가 다른 여러 가지 크기의 과립이 혼재하며 이는 centrifuge(분획 원심법)를 사용한다. 이는 크기에 따라 침강하는 속도가 다른 것을 이용하는 분획법으로 따라서 가장 큰 과립인 핵이 먼저 침강하고 mitochondria lysosome(미토콘드리아 리소좀), 소포체 순으로 침강한다. 이는 단백질을 분리하는 데 중요한 원리이다.
1.4. Protein Separation Methods
1.4.1. Homogenization
Homogenization은 물리적인 힘을 이용하여 세포나 조직을 부수는 방법이다. 이는 단백질을 추출하기 위한 대표적인 방법 중 하나이다.
Homogenization 과정에서는 조직을 분쇄하거나 마쇄하여 세포벽과 세포막을 파괴함으로써 세포 내부의 성분들이 용출된다. 이를 통해 단백질을 포함한 다양한 세포 구성 성분들을 추출할 수 있다.
Homogenizer라는 장비를 이용하여 기계적인 힘을 가해 조직을 분쇄할 수 있다. Homogenizer는 마찰력과 전단력을 이용하여 세포를 파괴하며, 균일한 세포 용액을 얻을 수 있다.
Homogenization 방법은 조직의 단백질을 효과적으로 추출할 수 있지만, 단백질의 변성을 유발할 수 있다는 단점이 있다. 따라서 단백질의 변성을 최소화하기 위해서는 적절한 온도 유지, 완충액 사용 등의 주의가 필요하다.
1.4.2. Sonication
초음파 처리(Sonication)는 단백질 추출 시 세포를 물리적으로 파괴하는 방법 중 하나이다. 초음파 처리는 세포벽과 세포막을 파괴하여 세포 내부 물질을 방출시키는 기능을 한다.
초음파 처리 과정에서 세포는 극심한 기계적 힘을 받게 되며, 이 과정에서 세포의 구조적 무결성이 손상되어 단백질을 포함한 다양한 세포 내 구성 성분들이 유출된다. 초음파 파동은 세포 내부에 압축과 팽창을 반복적으로 일으켜 세포막을 파괴하고, 이를 통해 단백질을 포함한 세포 내 물질들이 유출되게 된다.
초음파 처리는 기계적인 방법으로 세포막을 파괴하기 때문에, 다른 화학적 용해제를 사용하는 방법에 비해 단백질의 변성 위험이 낮다는 장점이 있다. 또한 초음파 파동의 세기와 처리 시간을 조절하여 단백질의 변성을 최소화할 수 있다. 그러나 지나치게 강한 초음파 처리는 단백질의 구조 및 기능을 손상시킬 수 있으므로, 단백질의 특성을 고려하여 최적의 초음파 처리 조건을 설정해야 한다.
초음파 처리를 통한 단백질 추출 시 주의해야 할 점은 다음과 같다. 첫째, 초음파 처리 시간이 너무 길거나 강도가 세면 단백질이 변성될 수 있다. 따라서 단백질의 특성을 고려하여 적절한 초음파 처리 조건을 설정해야 한다. 둘째, 초음파 처리 과정에서 발생하는 열로 인해 단백질이 변성될 수 있다. 이를 방지하기 위해 초음파 처리 시 샘플을 얼음 위에서 처리하거나 냉각 장치를 사용해야 한다. 셋째, 초음파 처리 과정에서 단백질 분해 효소의 활성이 증가할 수 있으므로 protease 억제제를 첨가하여 단백질 분해를 최소화해야 한다.
초음파 처리는 조직이나 단단한 세포벽을 가진 세포에 효과적이지만, 세포의 종류와 단백질의 특성에 따라 최적의 초음파 처리 조건을 실험을 통해 확립해야 한다. 또한 초음파 처리 이외에도 다양한 물리적, 화학적 방법들이 단백질 추출에 활용되고 있으므로, 실험 목적과 대상 시료에 맞는 적절한 추출 방법을 선택하는 것이 중요하다.
1.4.3. Freeze/Thaw
Freeze/Thaw 기법은 세포 용해를 위한 물리적 방법의 하나이다. 이 방법은 세포 내 단백질을 추출하기 위해 세포를 동결과 해동 과정을 반복함으로써 세포막을 파괴하는 것이 핵심이다.
동결 과정에서는 세포 내부의 수분이 얼게 되어 세포막이 파괴되고, 이후 해동 과정에서는 세포의 팽창과 수축이 반복되면서 세포막이 더 완전히 파괴된다. 이를 통해 세포 내부에 있던 단백질 등의 세포 성분들이 추출될 수 있게 된다.
이 방법은 특히 식물 세포와 같이 단단한 세포벽을 가진 세포에 효과적이다. 식물 세포의 세포벽은 세포막보다 단단하기 때문에 단순한 기계적 파쇄만으로는 효과적인 세포 용해가 어려운데, 동결-해동 과정을 통해 세포벽이 약화되어 쉽게 파괴될 수 있다.
따라서 식물 조직으로부터 단백질을 추출할 때 Freeze/Thaw 기법이 자주 사용된다. 다만 이 방법은 세포막 단백질과 같은 일부 단백질의 변성을 초래할 수 있다는 단점이 있다.
또한 Freeze/Thaw 과정에서 단백질의 변성을 최소화하기 위해 동결 보호제를 첨가하기도 한다. 이러한 동결 보호제에는 글리세롤, DMSO, 설탕 등이 포함될 수 있다.
결과적으로 Freeze/Thaw 기법은 단단한 세포벽을 가진 세포에서 단백질을 추출하는 데 효과적이지만, 단백질의 변성을 유발할 수 있는 단점이 있다. 따라서 추출하고자 하는 단백질의 성질에 따라 이 방법의 적용 여부를 신중히 고려해야 한다.
1.4.4. Reagent (Detergent)
Reagent (Detergent)는 세포 lysis를 위해 사용되는 화학적 방법 중 하나이다. 세포 lysis는 세포막이나 핵막을 물리적, 화학적 방법으로 파괴하여 세포 내부의 DNA, RNA, 단백질, 세포소기관 등을 획득하는 과정이다.
Detergent는 친수성과 소수성 부위를 모두 가지고 있는 양친매성 물질로, 세포막을 구성하고 있는 지질을 분해하여 세포막을 파괴하고 세포 내부의 성분들을 유출시킬 수 있다. Detergent에는 크게 이온성 detergent와 비이온성 detergent가 있다.
이온성 detergent인 SDS(sodium dodecyl sulfate)는 세포막과 핵막을 모두 효과적으로 용해시킬 수 있어 세포의 모든 구성 성분을 추출할 수 ...
