본문내용
1. 해조류 추출물의 항균능력 측정 및 천연항균제 개발
1.1. 연구 동기
얼마 전 유독성 가습기 살균제 때문에 무고한 소비자들의 생명을 앗아갔던 '옥시 가습기 살균제' 사건은 소비사회에 큰 변화를 가져왔다. 이들 가습기 살균제에 쓰인 살균물질 폴리헥사메틸렌 구아니딘(polyhexamethylene guanidine; PHMG)과 염화 올리고-(혹은 2-)에톡시에틸 구아니딘(Oligo(2-)ethoxy ethoxyethyl guanidine chloride; PGH)이 호흡기에 영향을 줬을 때의 독성을 연구가 되지 않았기 때문에 이런 사태가 발생하게 되었다. 이처럼 현재 시중에서 사용되는 항균제, 살균제의 종류는 방대한데에 비해, 그 연구는 심층적으로 이루어지지 않았다. 또한 이 외에도 현재 쓰이는 많은 항균성분들에 대해 발암 등 각종 신체에 대한 부작용, 내성반응 등의 문제점이 발견되고 있는 것이 사실이다. 그 결과로 소비자들의 화학물질에 대한 불신이 커지고 있으며 '케미포비아', '노케미족' 등 각종 화학물질 사용 반대와 관련된 신조어가 생겨나고 있다. 이러한 문제점을 가지고 있는 화학 살균성분, 항균성분을 대체할 수 있는 방안으로는 천연 항균제가 있다.
1.2. 연구의 목적
전 세계에서 흔히 발견할 수 있는 해조류를 이용하여 천연 항균제를 제작해보고 능력을 평가하는 것이 목적이다. 6종 해조류의 항균력을 측정하여 항균능력 여부와 효과를 측정하고 각 해조류별 추출물을 원심분리하여 항균물질을 찾은 후 다수의 해조류에게 일반화하여 적용하는 것이 실험의 목적이다. 이를 통해서 해조류를 통한 경제적인 이익을 산출하고 남는 자원을 활성화시켜 우리 전반에 도움이 되는 결과를 얻는 것이 목표이며, 더 나아가서 인공 항균제와 천연 항균제의 구체적인 차이점과 장단점을 알아보고 이를 보완하여 효율적이며 인체에 무해한 항균제를 만들어 볼 것이다.
1.3. 이론적 배경
1.3.1. 해조류의 정의
해조류는 바다에서 나는 조류를 통틀어 이르는 말이다. 해조류는 다시마 · 미역 · 톳 · 실말 등의 갈조류와 김 · 우뭇가사리 등의 홍조류, 그리고 파래 등의 녹조류 세 가지로 크게 구분된다. 해조류에서 조류란 은화식물(Cryptogam : 포자로 번식하는 식물을 지칭하는 식물의 2대 분류군 중 하나)의 한 무리를 지칭하는 단어로 물 속에 살면서 엽록소로 동화작용을 한다. 확실하게 정의된 분류군은 아니지만 물 속에 사는 엽록소를 가진 엽상식물을 관습적으로 부르고 있다. 이들은 뿌리, 줄기, 잎이 구별되지 않고 포자에 의하여 번식한다. 즉, 이들의 몸에는 뿌리로 흡수한 물이나 영양을 잎으로 보내는 '물관'이나, 또 잎에서 이루어지는 광합성 작용으로 만들어진 녹말 같은 생산물을 저장 장소로 옮기는 '체관' 같은 조직이 없다. 뿌리처럼 보이는 것(부착기: holdfast)도 몸체를 바위나 말뚝 같은 단단한 물체에 고착시키는 역할만 하지 영양을 흡수하는 구조는 아니다.
1.3.2. 대장균의 정의
Escherichia속 세균의 1종이다. 사람을 포함해서 포유류의 장관을 기생장소로 하고 있는 장내세균으로, 통성혐기성 그람음성의 간균이며 글루코오스를 분해하여 산을 생산한다. 보통 (2~4)×(0.4~0.7)μm의 크기지만 장축이 특히 짧아서 구균에 가까운 형태의 균도 있다. 사람이나 동물의 분변에 오염된 외계에 널리 존재하기 때문에 음료수, 수영장이나 식품의 변질에 의한 오염을 검사하는 지표가 된다. 지금까지 건강인의 장관에 상재하고 있기 때문에 장관 내에 존재하는 한 병원성은 없는 것으로 여겨지며 특히 대장균 K12주(E. coli K-12)는 분자생물학과 생물공학의 연구재료로서 널리 이용되어 왔다.
1.3.3. 황색포도상구균의 정의
황색포도상구균은 건강한 사람이나 가축의 피부와 비강표면에 일반적으로 존재하고 있는 생육함에 따라 세포집괴(덩어리)를 형성하는 그람양성의 통성혐기성 세균이다. 이 세균은 내열성인 외독소를 생산하여 식중독을 일으키며, 식세포를 죽이는 독소(류코시딘), 용혈소, 응고효소 등을 분비하여 감염숙주세포의 저항성에서 벗어나 화농성 감염증을 일으킬 수 있다. 또한 페니실린 발견의 단서가 된 세균으로도 유명하며, 최근 병원내 등에서 대부분의 항생물질에 저항성을 나타내는 균주인 MRSA(메티실린내성황색포도상구균)가 출연하고 있다.
1.3.4. 디스크 확산법의 정의
디스크 확산법은 화학요법제감수성검사법의 한 종류이다. 일정량의 약제를 함유하는 여과지(디스크)에 의한 균발육저지대에서 감수성을 결정하는 방법이다. 각종의 세균이 항생물질에 대하여 어느 정도 감수성을 가지고 있는지를 조사하는 방법이다. 디스크는 원형 또는 정방형의 여과지로 일정농도의 항생물질이 포함되어 있다. 3농도디스크법과 1농도디스크법의 두 종류가 있으며, 전자는 고, 중, 저농도의 항생물질을 포함한 3종류의 디스크를 사용하고 후자는 일정농도의 항생물질을 포함한 디스크를 사용한다. 배지에 분리된 균을 심어 디스크를 놓고 24시간 후 디스크 주변부의 저지대 유무 또는 크기로부터 피검균의 감수성 유무를 추정한다. 최근에는 Kirby-Bauer법에 의한 1농도디스크법이 널리 사용되고 있다.
1.3.5. 클린벤치의 정의
클린벤치는 무균작업 실험대(sterile air hood)라고도 한다. 실험대 공간에 분진, 포자 등이 들어 있지 않은 깨끗한 공기로 채우는 장치이다. 주로 작업 중 시료나 기구 내에 세균이나 곰팡이 등의 미생물이 혼입하는 것을 방지하기 위해 사용한다. 앞면을 제외하고 칸막이한 작업대가 있는 공간에 필터로 분진을 제거한 공기가 흘러 들어가는 장치로 되어 있다. 수평기류방식과 수직기류방식이 있으며, 작업대에 멸균용 가스버너 또는 알코올 램프, 소독액을 상치(常置)해서 사용하는 경우가 많다. 또한 일반적으로 사용하지 않을 때에는 살균 등을 켜두어 작업 공간 내의 무균 상태를 유지하는 것이 좋다. 필터는 정기적으로 세척하고 교환할 필요가 있다.
1.3.6. 원심분리기의 정의
원심분리기는 회전에 의해 생기는 원심력을 이용해서 시료를 분획하는 장치이다. 시료가 들어있는 용기를 유지하면서 회전하는 로토(rotor)와 로터를 회전시키는 원심기 본체로 되어 있다. 사용하는 용기의 형태나 크기에 따라 여러 종류의 로터가 있다. 시험관을 사용하는 경우, 로터는 회전 중에 시험관과 수평면에서 이르는 각도에 따라 수직로터, 고정각로터, 수평로터의 3종류로 나누어진다. 이런 순서로 시료의 분리능이 향상되지만 반면에 분리에 소요하는 시간이 길어진다. 이밖에도 마이크로 프렛을 회전시키기 위한 로터와 세포나 세포내소기관을 분리하기 위한 세정로터 등이 있다. 원심기 본체는 주로 로터의 회전속도에 따라 분류되는데, 속도가 증가함에 따라 수동원심기, 저속원심기, 고속심기, 초원심기 등으로 부른다. 또, 저속(또는 고속)원심기 등이 냉각기능을 갖추었을 때는 저속(또는 고속)냉각원심기라 한다.
1.4. 실험계획
1.4.1. 배지 제작
배지 제작은 실험을 진행하기 위한 필수적인 과정이다. 실험에서는 BPA배지와 LB배지를 사용하였는데, 이를 제작하는 과정은 다음과 같다.
먼저 BPA배지 분말 12.6g과 LB배지 가루 8g을 각각 계량하여 삼각 플라스크에 증류수 200ml을 넣고 혼합한다. 혼합한 용액을 삼각플라스크에 넣어 호일로 2중 밀봉한 후 핫플레이트에 넣어 가열하고 교반시키면서 가루를 녹인다. 가루가 완전히 녹으면 물이 끓고 있는 압력밥솥에 삼각 플라스크를 넣고 약 20분간 고압멸균한다. 밥솥 안의 증기를 빼낸 후 삼각 플라스크를 클린 벤치 안에 넣고 약 50도까지 식힌다.
준비된 멸균된 샬레에 LB배지 용액을 20ml정도 붓고 굳힌다. BPA배지에 난황을 5ml정도 넣고 혼합한 뒤 샬레에 20ml정도 붓고 굳힌다. 완전히 굳은 배지는 파라필름으로 밀봉하고 냉장보관 한다.
이처럼 BPA배지와 LB배지를 제작하는 과정을 통해 실험에 필요한 배지를 준비하였다. 이렇게 제작된 배지는 이후 균류 배양 및 실험에 사용된다.
1.4.2. 균류 배양
균류 배양은 실험을 수행하기 위해 필수적인 과정이다. 실험에 사용될 대장균과 황색포도상구균을 배양하는 단계이다. 실험계획에 따르면 먼저 실험 20분 전에 클린벤치의 UV램프를 켜 내부를 소독하고 소독용 알코올로 닦는다. 이후 각 세균 별 배지에 각각 대장균, 황색포도상구...
