겔 여과 크로마토그래피 실험방법

소개

자연과학을 전공한 학생들에게 유용한 자료입니다.

목차

겔 여과 크로마토그래피 실험방법
1. 원리
2. 준비물
1) 시료
2) 시약
3) 기구 및 기계
3. 실험방법
(1) Prepa column 및 HPLC의 경우
(2) Open칼럼의 경우

본문내용

겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)는 단백질을 분자량의 크기로 분리한다는 가장 단순한 크로마토그래피로서, 조정제로부터 중간정제, 최종정체까지의 어느 단계에서도 실시할 수 있다. 세포나 조직으로부터 단백질을 정제하기 위한 것만 아니라 항체의 정제나 재조합 단백질의 분리, 천연 펩티드의 정제 등, 폭 넓은 목적으로 이용된다. 단, 항체에 샘플을 결합시키는 크로마토그래피와는 다르며, 샘플의 양이 분리능에 크게 영향을 주기 때문에 한번에 적용할 수 있는 샘플의 양은 담체 용적의 5%미만(2%가 일반적임)으로 제한되어 있다. 또한 분획 후의 샘플의 양은 분획 전보다 많아지기 때문에 목적에 따라 어느 정제단계에 겔 여과를 실시할 것인지를 고려할 필요가 있다.

1. 원리
겔 여과에 이용되는 담체(겔)는 다양한 망목상 구조를 가진다. 큰 분자는 겔 내부의 망목에는 들어가지 못하기 때문에 겔 입자끼리의 간격을 통과하여 이른 시간에 용출된다. 중정도의 분자는 겔 내부의 큰 망목을 통과하며, 작은 분자는 더욱 세밀한 망막을 통과하여 용출되기 때문에, 그만큼 용출시간은 늦어지게 된다.

2. 준비물
1) 시료
-샘플: 충분하게 가용화하고 미리 0.22-0.45um 필터에 통과시켜 시료중의 불순물, 미립자를 제거하여 둔다.
(샘플은 완전히 가용화 해 둘 것, 가용화가 불충분하면 단백질이 응집 등에 의해 고분자화 되어 버리기 때문에 정확하게 분리할 수 없게 된다.)
2) 시약
- 0.1-0.5M이상의 염(NaCl등)을 포함한 Tris등의 완충액
(단백질이 안정하다면 어떤 완충액도 사용가능하다. 염은 칼럼으로의 비특이적인 단백질의 흡착을 방지하기 위해 반드시 넣을 것)
- 분자량 마커: 미리 0.22-0.45 um 필터에 통과시켜 시료중의 불순물, 미립자를 제거하여 둔다.
(마커는 샘플에 사용한 것과 같은 완충액에 용해한다. 또한 2개 이상 마커를 사용하는 경우는 2배 이상의 분자량 차이의 것을 사용하여 용출 위치를 조사하면 좋다. 단 Blue dextran 2000은 알부민 등의 단백질에 결합하는 성질이 있기 때문에, 단독으로 사용할 것)

참고자료

· 없음