[A+]서강대학교 현대생물학실험1_2차 풀레포트_6x His tagged eGFP발현 후 단백질 정제 및 획득, 단백질 확인 및 정량으로 eGFP 순도 확인

소개

"[A+]서강대학교 현대생물학실험1_2차 풀레포트_6x His tagged eGFP발현 후 단백질 정제 및 획득, 단백질 확인 및 정량으로 eGFP 순도 확인"에 대한 내용입니다.

목차

Abstract
Introduction
Materials & Methods
Results
Discussion
References

본문내용

EGFP는 해파리 Aequorea victoria에서 발견된 GFP가 변형된 형태로 488nm에서 excitation이 일어나도 509nm에서 형광을 방출한다. Reporter gene으로 사용되며, Target gene의 발현 정도를 확인하고, 세포 내에서 단백질의 발현 부위를 관찰한다. EGFP를 발현시켜 정제한 뒤 획득하여 정량 과정을 거쳤다. 본 실험에서 eGFP를 얻기 위해 6x His-tagged eGFP gene이 삽입되어 있는 pET28a(+)를 이용하였고, BL21(DE3)에 transformation하였다. T7 RNA polymerase를 lac operon system에 IPTG를 이용하여 지속적으로 induction시키고, 6x His-tagged eGFP를 과발현 시켰다. Immobilized metal ion affinity chromatography를 이용하여 Histidine과 Ni2+-NTA resin과 특이적으로 결합하여 목적 단백질을 순수 정제하였고, Amicon centrifugal fulter tube를 이용하여 ultrafiltration을 진행했다. SDS-PAGE를 통해 정제한 단백질의 분자량에 따른 band를 확인하였으며, whole lysate나 Flow through는 여러 위치에서 band가 관찰되는 반면, 최종 정제 eGFP의 경우 28.3 kDa 위치에만 두꺼운 band가 확인되어 정제가 잘 이루어 짐을 알 수 있다. 280nm, 488nm에서 Extinction coefficient assay를 하여 구한 eGFP의 농도는 각각 0.298mM, 0.199mM로 total eGFP, functional eGFP 농도를 나타낸다. Lowry assay로 구한 eGFP의 질량농도는 BSA를 이용하여 standard curve를 그려 얻어낸 값으로, 13.78mg/ml이며, 몰농도는 0.487mM이다.

참고자료

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