구강상피로부터 유전자의 추출 (HKG 이용 PCR & 전기영동) 실험 보고서

소개

"구강상피로부터 유전자의 추출 (HKG 이용 PCR & 전기영동) 실험 보고서"에 대한 내용입니다.

목차

1. Introduction

2. Materials and Apparaturs

3-1 Methods for PCR
3-2 Methods for Electrophoresis

4. Result

5. Discussion
5-1 Electrophoresis 결과 해석
5-2 PCR 단계별 시약
5-3 Electrophoresis 시약, 원리
5-4 GAPDH & HKG
5-5 PCR Cycle 중 Annealing 단계의 중요성
5-6 RT PCR
5-7 등온증폭(LAMP, Loop-Mediated Isothermal Amplification)란?

6. Reference

본문내용

1. Introduction
지난 실험에서 원하고자 하는 genomic DNA가 제대로 추출되었는지 확인하기 위해 GAPDH Primer를 이용한 PCR을 하였다. PCR이 정상적으로 이루어졌는지 확인하기 위하여 전기영동을 진행하고 각 세부단계를 조사해보았다.
PCR 단계는 다음과 같다. 한 cycle은 Denaturing, Annealing, Extending 단계가 반복된다.
Denaturation 단계는 95℃까지 온도를 올린후 2~5분동안 incubation시켜 dsDNA가 ssDNA로 분리되게 한다. 상보적인 염기간 수소결합을 끊어주는 단계이다.
Annealing 단계는 95℃도에서 rimer의 melting Temperature보다 대략 5도 정도 낮은 온도(주로 45℃에서 60℃ 사이)로 낮추고 짧은 시간(30초 ~1분)동안 지속한다.
해당 단계는 Primer의 염기서열에 따라 다르기에 실험적으로 적정온도를 찾아야한다.
Extension 단계는 본격적인 elongation이 일어나는 단계로 Thermus aquaticus균이 지닌 Pol의 활성이 가장 좋은 온도인 72℃로 다시 올리게 된다. 해당 pol은 72℃에서 10초 이내 1000bp 정도를 합성할 수 있다. DNA의 Denaturation을 위한 94℃에 노출시키면 활성은 없지만 반감기가 9분 이상으로 나타난다.(F C Lawyer, 1993)
Electrophoresis
백금으로 이루어진 극에서는 물의 전기분해가 일어난다. TAE buffer가 가득찬 용액 자체도 회로의 일부로서 (-)극은 물분자가 전자를 얻어 수소기체를, (+)극에서는 전자를 잃어 산소기체를 발생시킨다.

2. Materials and Apparaturs
PCR - PCR premix(dNTP, 10XBuffer, taq polymerase, , glycerol, dye) tube, gDNA, 3차 증류수(DW), Thermal Cycler, 10㎕ pipette & tip, 4℃ fridge, pcr tube rack

참고자료

· Sigmaaldrich – Polymerase Chain reaction, Technical guide to PCR Tech
· Researchgate - TECHNIQUES IN MOLECULAR BIOLOGY, Horizental gel electrophoresis
· Brown, T. A. (2018). Genomes 4. Garland science.
· Lawyer, F. C., Stoffel, S., Saiki, R. K., Chang, S. Y., Landre, P. A., Abramson, R. D., & Gelfand, D. H. (1993). High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5'to 3'exonuclease activity. Genome research, 2(4), 275-287.
· Silver, N., Best, S., Jiang, J., & Thein, S. L. (2006). Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC molecular biology, 7(1), 1-9.
· Bercovich, D., Regev, Z., Ratz, T., Luder, A., Plotsky, Y., & Gruenbaum, Y. (1999). Quantitative ratio of primer pairs and annealing temperature affecting PCR products in duplex amplification. BioTechniques, 27(4), 762-770.
· Markoulatos, P., Siafakas, N., & Moncany, M. (2002). Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. Journal of clinical laboratory analysis, 16(1), 47-51.
· Kumar, S., Tsai, C. J., & Nussinov, R. (2000). Factors enhancing protein thermostability. Protein engineering, 13(3), 179-191.
· Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., & Hase, T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research, 28(12), e63-e63.