[분자생물학실험]Buffer 및 Media 제조와 재조합 단백질 Taq DNA Polymerase 발현, 정제와 측정

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2021.03.01
최종 저작일
2021.02
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소개글

"[분자생물학실험]Buffer 및 Media 제조와 재조합 단백질 Taq DNA Polymerase 발현, 정제와 측정"에 대한 내용입니다.

목차

1. 실험 이론 및 원리
1) 실험 요약
2) 실험 소개

2. 실험 방법
1) Buffer와 media의 선택 및 조제
2) 재조합 단백질 Taq DNA polymerase 발현
3) 재조합 단백질 Taq polymerase 정제
4) 재조합 단백질 Taq polymerase의 확인

3. 실험 결과
1) 결과 분석

4. 토의 사항
1) 실험 고찰

본문내용

본 실험에서는 고온에서 사는 Thermus aquaticus로부터 추출한 Taq polymerase 유전자를 pTTQ18 벡터에 삽입하여 IPTG를 이용해 대장균에 과발현시키고 정제하여 PCR을 통해 유전자를 증폭하고 전기영동으로 이를 확인하고자 한다. 먼저 LB media와 pH변화에 저항하여 생물의 항상성을 유지하는500mM EDTA solution과 resuspension, lysis buffer를 만들고, Cell을 유리시험관에 접종해 배양 후 플라스크에 옮기고 Taq DNA 중합효소를 발현시키게 하는 IPTG를 넣는다 (OD600값:0.4~0.6). Cell down 후, 펠렛을 resuspension buffer로 풀어주고 원심분리 후 pellet을 pre-lysis buffer로 풀고 lysis buffer와 100mM PMSF를 넣은 후 배양한다. 여기에 Storage buffer를 넣고 원심분리후, 상층액에 ammonium sulfate을 넣는다.(뿌옇게 침전) 다시 원심분리후 생성된 pellet을 resuspension시켜 dialysis tube에 넣어 storage buffer에 Dialysis시킨다. Taq polymerase를 제외한 PCR component가 들어있는 master mix를 PCR tube에 분주하고 negative control(DW)와 positive control(시중판매 Taq pol) 및 1X, 1/4X, 1/8X, 1/16X로 희석된 taq polymerase를 첨가해 이를 증폭하는 PCR을 진행한다. Agarose gel을 만들고 dye인 EtBr을 넣은 gel plate에 부어 굳힌다. 샘플의 밀도증가를 위해 6X loading dye를 넣고, 로딩 후 전기영동을 하여 UV detector로 확인한다. 그 결과, DW는 Taq pol이 없어 밴드가 나타내지 않았고, 확인하고자 한 752bp의 Taq polymerase DNA는 시중판매되는 Taq pol과 동일한 위치에 관찰되었다.

참고 자료

T.A.Brown , 2006 ,Gene cloning & DNA Analysis (5th ed), WORLD SCIENCE Co , pp.181-192
McMurry, John E Fay, Robert C, 2009, CHEMISTRY (5th ed), PEARSON EDUCATION ,pp.259-264
Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Jackson, 2012, Campbell Biology(9th ed), PEARSON EDUCATION, pp.351-354
Kenneth W. Raymond, 2019, General, Organic and Biological(4th ed), WORLD SCIENCE Co, pp577-580
Geoffrey M. Cooper, 2013, The Cell: A Molecular Approach(6th ed), WORLD SCIENCE Co, pp.118-129
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