Mammalian cell culture Real time PCR

최초 등록일
2017.12.13
최종 저작일
2017.12
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먼저 Real Time PCR에 의한 정량 매커니즘을 살펴보자. Real Time PCR에서는 PCR 증폭산물을 Real Time으로 모니터링하여 증폭이 지수적으로 일어나는 영역에서 정량 하기 때문에 기존 기술인 RT-PCR법과 달리 PCR의 증폭속도 이론을 기초로 정확한 정량이 가능하다. PCR에서는 1 cycle마다 DNA가 지수적으로 증폭하다가 plateau에 도달한다. 이 증폭의 모습을 Real time으로 모니터링한 그림이 증폭곡선이다. 아래의 모식도는 DNA 농도(실제의 증폭산물량)를 청색으로 나타내고 그것을 형광으로 검출한 signal 강도를 적색으로 나타내었다. PCR 증폭산물량이 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 signal이 상승하다가 plateau에 도달한다.

초기 DNA량이 많을수록 증폭산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 Real time PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 threshold를 설정하면 threshold와 증폭곡선이 교차하는 지점: Ct값 (Threshold Cycle)이 산출된다.Ct값과 초기 주형량 간에는 직선적인 관계가 있어 아래 그림과 같은 검량선을 만들 수 있다. 미지의 시료에 대해서도 표준시료와 마찬가지로 Ct값을 산출하여 이 검량선과 대조하면 초기 template량을 구할 수 있다.

<중 략>

장치

Real time PCR를 하기 위해서는 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 Real time PCR 전용 장치가 필요하다. Thermal cycler로 DNA를 PCR 증폭시키면서 분광 형광 광도계로 그 증폭산물을 측정해 나간다. 다양한 기종의 Real time PCR 장치가 판매되고 있는데, 고속으로 PCR 반응이 되도록 연구된 것과 96 well plate 단위로 반응할 수 있는 것 등 다양한 특성을 갖춘 장비들이 판매되고 있다.

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