생화학 레폿 - PCR 전기영동

최초 등록일
2013.03.23
최종 저작일
2011.11
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목차

1. Protocol
2. Result
3. Discussion

본문내용

실습주제: Total RNA preparation(RNA quantification)
cDNA synthesis
PCR amplification for target gene (beta-actin)

Polymerase Chain Reaction (PCR)
- 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관 내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다.
중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro 상에서 특정 부위의 DNA를 10의 5~10의 8배까지 수 시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 다음과 같이 여러 가지 실험에 이용할 수 있다.

* 3 Steps *
1) DNA의 변성 (denaturation)
- 90℃에서 96℃로 가열하여 double strand DNA (ds DNA)를 single strand DNA (ssDNA) 로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94℃로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.

2) Primer의 결합 (annealing)
- 50~65℃에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 다음 표와 같다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합 온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.

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