[생화학 실험보고서] Detection of subcloning

소개

Transformation된 cell을 키운 후 alkali를 이용하여 cell을 깨고 protein을 변성시키는 방법으로 plasmid DNA를 대장균에서 분리하여 subcloning 여부를 확인하는 실험입니다.

목차

1. 목적

2. 원리

3. 시약 및 기자재

4. 실험방법

5. 실험결과

6. 고찰

7. 참고문헌

8. Further study

본문내용

1. 목적
Transformation된 cell을 키운 후 alkali를 이용하여 cell을 깨고 protein을 변성시키는 방법으로 plasmid DNA를 대장균에서 분리하여 subcloning 여부를 확인한다.


2. 원리
1) Small scale preparation of plasmid DNA by alkali
Alkaline solution이 base pairing을 완전히 파괴시키는 성질을 이용한다. 이러한 alkaline solution은 선택적으로 chromosomal DNA와 protein만을 denature시키는데 closed circle DNA의 경우 topologically interwined되어 있기 때문에 각 strand는 분리되지 않게 된다. 이후 neutralization동안 chromosomal DNA, bacterial protein들은 충분히 침전되고, native plasmid DNA는 supernatant 상태로 존재하므로 분리가 가능하다.

<중략>

4. 실험방법
Ⅰ. Small-scale preparation of plasmid DNA by alkali
Ⅰ-1. Harvest
1) Prep. 하기 하루 전에 transformation 했던 cell 중에서 white colony만 LB-amp 배지 2 ㎖에 접종하여 37 ℃ shaking incubator에서 overnight로 배양한다(blue colony는 subcloning이 되지 않은 vector plasmid가 transformation 된 경우임).
2) 키운 세포를 1.5 ㎖ tube에 넣고 14K rpm에서 1분 동안 원심분리한다.
3) Pipetting으로 media를 제거한다.
Ⅰ-2. Lysis by alkali
1) Pellet을 disperse 시키기 위해 ice-cold Solution 1을 100 ㎕ 첨가한다. 이 때 clump가 없어질 때까지 vortexing하여 cell이 완전히 resuspend 되도록 한다. Ice에서 5분정도 방치한다.
2) Cell을 깨기 위해 Solution 2를 200 ㎕ 첨가하고 잘 혼합시키기 위해 inverting한다. 이 때 vortexing은 절대 금지!(vortexing하면 genomic DNA가 깨져서 plasmid prep.에 contamination 됨). Ice에서 5분 정도 방치한다.
3) Solution 3을 150 ㎕ 첨가하고 잘 inverting한다. Vortexing 절대 금지! Ice에서 5분 정도 방치한다. Chromosomal DNA contamination에 주의한다.
4) 14K rpm에서 5분간 centrifugation하여 supernatant를 조심스럽게 새 tube에 모은다.

참고자료

· 생화학실험(2) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
· Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. 2007, Biochemistry, sixth ed.
· http://en.wikipedia.org/wiki/
· http://100.naver.com