대장균에서의 T4 DNA ligase 클로닝, 발현 및 단백질 정제 실험 결과 보고서

소개

한학기 동안 생물학, 생명과학 실험 수업에서 진행한
대장균에서의 T4 DNA ligase 를 클로닝 후 발현확인 실험과 발현된 단백질 정제 실험의
결과 보고서 입니다.

목차

1. Intoduction

2. Materials and method

3. Result and discussion

본문내용

Intoduction
T4 DNA ligase는 생명과학에서 널리 사용되는 중요한 단백질이다. Bacteriophage T4의 DNA ligase gene을 개량한 후, cloning하여 E.coli에서 발현, 정제한 recombinant type의 제품으로 DNA, RNA를 연결하는 목적으로 사용된다. T4 DNA ligase는 ATP를 cofactor로 사용하여 juxtaposed 5`-phosphate와 3`-OH를 phosphodiester 결합을 형성, 연결시켜주는 효소 이다. T4 DNA ligase는 cohesive-end, blunt-end를 모두 연결시킬 수 있으며, single strand에 형성된 nick에도 작용 한다1).
T4 DNA ligase를 효율적으로 생산하기 위해 E.coli (DE3) pLysS를 사용했다. 이 균주는 T7 polymerase를 발현하여 T7 promotor에 붙어있는 gene을 expression 하는 기능을 가진다. 또한 평소에는 T7 ligase의 inhibitor를 translation하여 실험자가 원하는 insult가 발현되지 않도록 조절한다. 이 대부분이 lac operon에 의해 조절되어서 IPTG를 통해서 T7 ligase의 발현을 조절하고, 그 결과 원하는 protein의 생산을 조절 할 수 있다.

Materials and method
Vector transformation
E.coli DH5a를 competent cell로서 미리 준비하였다. 준비된 pET-21a(+)Mal-TEV 플라스미드 벡터 용액 1μL, 증류수 100μL, 그리고 competent cell 100μL를 섞어서 혼합용액을 만들었다. 이 용액을 즉시 ice bucket에 넣고 15분 동안 배양한다. 그 후 42°C에서 80초간 열 충격을 주었다. 이 용액을 LB solution(구성을 모름)1mL에 넣은 후 37°C에서 30분간 배양했다. 그리고 배양한 용액을 12000rpm으로 1분간 원심 분리했다. 상청액을 제거한 후 다시 LB solution을 150μL를 넣어 pipeting을 통해서 섞어주었다. 용액을 LA plate(ampicillin) 도말한 후 plate를 하룻밤동안 배양했다.

Plasmid Dna mini-preparation
transformation에서 하룻밤 동안 배양했던 plate에서 colony를 pipet tip을 이용하여 집어낸뒤 LB 용액에서 또다시 하룻밤 동안 배양했다. 배양한 박테리아를 Ep-tube에 모아서 그것을 13000rpm에서 1분동안 원심 분리하여 상청액을 제거했다. pellet에 S1 buffer(Glucose/Tris-Cl/EDTA) 250μL을 넣고 vortex하여 resuspension을 발생시켰다. 그리고 S2 buffer(NaOH/SDS) 250μL를 넣고 tube를 위아래로 5번 뒤집었다. 5분 동안의 반응시간을 두었다. S3 buffer(Na-acetate) 350μL를 넣고 다시 tube를

참고자료

· http://www.solgent.co.kr/