단백질 분리와 추출과 정제의 모든 과정에 대해서

소개

1. 단백질 추출과 정제의 과정
단백질 정제
모든 단백질들을 정제하는 한 가지 간단한 방법은 없다. 한 단백질의 정제에 유용한 방법은 또 다른 단백질의 변성을 가져올 수 있다. 단백질 정제에 있어서는 조잡한 단백질 혼합물에 있는 여러 단백질들의 물리적 및 화학적 성질들에 있어서의 근소한 차이를 이용한다. 이러한 차이점들의 정확한 본질을 미리 알고 있지 못하기 때문에 정제방법은 필연적으로 시행착오를 통해서 알게 된다. 세포에서 한 가지 균일한 단백질을 얻으려면 보통 다음과 같은 많은 방법들을 순차적으로 응용해 보아야 한다.

용해성
수용액에 있어서의 단백질들의 용해도는 극성인 물 분자들과 단백질 분자들의 이온화된 원자단들 사이의 친수성 상호작용에 따라서 결정된다. 그러므로, 수용액의 유전상수 또는 이온의 세기를 변화시킬 수 있는 시약들은 단백질의 용해도 에 영향을 미칠 것이다. 단백질의 변성을 피할 수 있는 낮은 온도에서 에탄올, 아세톤, 또는 황산암모늄과 같은 염들을 첨가하면 단백질이 침전된다. 이러한 기법들을 단계적으로 사용함으로써 단백질 혼합액에 있는 단백질들을 분별 침전시킬 수 있다.

목차

1. 단백질 추출과 정제의 과정
2. 원심분리법
3. 가염석출
4. Chromatography를 이용한 단백질 분리
5. 전기영동

본문내용

4. Chromatography를 이용한 단백질 분리

Chromatography의 원리

• Chromatography의 어원:
Tswett(1903년)이 식물의 색소를 분리하며 사용(chroma, Greek어로color를 뜻함).
오늘날은 색깔과는 무관하게 화학물질(chemical species)을 분리하는 기술을 의미.
• 생체분자들(biomolecules)은 다양한 범위의 크기, 모양, hydrophobicity등을 갖기 때문에
이들을 분리할 때 한 가지 chromatography 방법만으로 불충분
=>두 가지 이상의 chromatography법 이용

Partition coefficient(분배계수)

• 한 물질을 두 가지 상(two-phase)으로 이루어진 시스템(예: liquid-lquid, liquid-solid)에
적용 시키는 경우, 이물질의 열역학적 특성 및 상들의 특성에 따라 두 상들에 다른 농도로
분포.
–Liquid-liquid system : 각각의 액상에 대한 상대적인 용해도가 partitioning에 영향.
–Liquid-solid system : 고체상에의 흡착(adsorption)이 partitioning에 영향.
물질들의 고체상과의 상호작용

• Column chromatography: solid를 column에 충전하여 분리하는 방법으로, 이때solid를 정지상(stationary phase), liquid를 이동상(mobile phase)이라고함.
• 정지상과 이동상에서의 시료물질의 partition되어있는 농도비를 partition coefficient
(분배계수)라고하며 K로 표시.
K = Cs/Cm
Cs: 정지상에서의 시료농도
Cm: 이동상에서의 시료농도
• 물질마다 독특한 분배계수를 가짐 => column에서 다른 속도로 이동 => 분리가 이뤄짐.
• Temperature, solvent polarity 등이 K값에 영향.

Phase systems used in bioscience

• 고체상은 보통 solid particles 또는 액체물질을 coating한 solid particles 이용.
solid particles로는 cellulose나 agarose등의 polymer를 이용.
• Bonded phase liquid chromatography: solid particles에 chemical groups을
공유결합으로 고정화.
• Liquid-liquid phase chromatography: 액체물질을 비공유 결합으로 고정화
(예: silica coated with a non-polar hydrocarbon).


이동상에 따른 chromatography의 분류

• Liquid chromatography(LC, 액체크로마토그래피법): 이동상이 액체.
–Partition chromatography mode: 시료물질들이 고체상을 통과하면서 분리됨
(예: gel filtration)
–Adsorption chromatography mode: 시료물질들이 먼저 고체상에 흡착되고 나중에
분리됨(예: ion exchange chromatography).
• Gas chromatography(GC, 기체크로마토그래피법): 이동상이 기체.
–200-250 ºC 온도에서 시료물질을 기체화시켜 분리
–이동상이 기체
–Sterols, 탄수화물, 지방산 등의 분리에 이용

A typical liquid chromatography experiment

• Ion exchange chromatography 방법에 의한 isozyme들의 분리.
0-100 mM NaCl gradient(dashedline)을 적용, 280 nm에서흡광도측정.
(Binding 안된 물질과 binding된 물질들 중 고정상과의 친화도의 강도순서는?)



Performance parameters(성능지수) used in chromatography

• 서로 다른 제조업체의 제품들, 또는 약간씩 다른 고정상들의 성능을 검증할 때
이용하는 지수.

1. retention: 물질이 column을 통과하는데 걸리는 정도.
–retention time(tR): 시간으로 표시
–retention volume(VR): 부피로 표시
• VR= ftR
• VR: retention volume(ml), tR: retention time(min), f: flow rate(ml/min)

참고자료

· 6. 참고문헌
· http://blog.naver.com/neufyoung?Redirect=Log&logNo=40008342609
· http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/protein_purify_ep.php
· http://blog.naver.com/alwayswish?Redirect=Log&logNo=60049131694
· http://blog.naver.com/korunouy433?Redirect=Log&logNo=30007699078
· http://202.20.99.17/~jjkim/lab/Restriction/Agarosegel.htm
· http://www.komabiotech.co.kr/etc/cool/electophoresis.htm
· http://user.chollian.net/~hl5nol/chromato-m.htm
· http://www.molecularstation.com/ko/proteomics/protein-separation-techniques/
· http://yasuar.hihome.com/lifescience/proteinjungjae.htm