Preparation(extraction) of plasmid DNA

소개

Preparation of plasmid DNA 방법-mini & large 각각의 방법과 원리, 그리고 실험 방법 중 각각의 step이 가지는 의미, 특정 시약이 쓰이는 이유에 대한 리포트

목차

1. Small-scale Alkaline lysis(Bimboim, Doly, 1979)

2. Small-scale Boiling lysis.

3. Large-scale CsCl/EtBr centrifugation

4. Large-scale DNA preparation by Column

본문내용

1. Small-scale Alkaline lysis(Bimboim, Doly, 1979)
: 기본이 되는 일반적으로 쓰이는 분리방법,
Chromosomal DNA와 plasmid DNA의 구조적 차이(linear/supercoild DNA)로 분리.

<procedure>
Preparation of cells

1. 적당한 항생물질이 섞인 3ml LB broth에 배양접시에서 자란 colony를 한개 취하여 배지에 옮겨 37℃, 12~16hr 동안 흔들면서 배양한다.

2. Harvest : 균이 가득자란 액체 배지 1.5㎖을 microfuge tube에 옮겨 담고, 1분간 상온에서 12.000rpm으로 원심 분리하여, 가능한 bactreial pellet만 남기고 상층액을 제거한다.


Lysis of cells

3. RNase(final 20 ㎕/㎖)가 들어간 solutionⅠ 100㎕를 넣고, vortexing (absolutely suspension).

Solution Ⅰ
- 50mM Glucose : 삼투압 유지, 세포 외형 유지
- 25mM Tris-Hcl (pH8.0) : Buffer
- 10mM EDTA (pH8.0) : 세포벽의 integrity를 유지하는데 필수적인 칼슘 이온을 제거, 세포벽을 파괴함.

4. solutionⅡ 200㎕를 넣고 3-4회 inverting, 얼음에 5분간 둔다.

Solution Ⅱ
- 0.2N NaOH : DNA를 denaturation시킴.
- 1% SDS(ionic detergent) : 세포막을 깸, 세포막의 지질 분자 제거.
☞ 주의-chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게 처리.

참고자료

· 없음