세포외 소포 연구를 위한 보관, 분리 및 특성 분석 가이드라인 (Guidelines for the Storage, Isolation, and Characterization of Extracellular Vesicle Research)

서지정보

· 발행기관 : 대한소화기암연구학회
· 수록지 정보 : Journal of Digestive Cancer Research / 13권 / 1호 / 9 ~ 29페이지
· 저자명 : 채신원, 정우철, 이윤진, 최동식

초록

인간을 포함한 다세포 생물에서 박테리아와 같은 단세포 생물까지 세포 간 정보 교환은 생명 현상의 필수적인 과정이며, 세포는 이러한 정보 교환을 수행하기 위해 호르몬 및 사이토카인과 같은 단일 물질을 분비할 뿐만 아니라 세포외 소포(extracellular vesicles, EVs)로 알려진 지질, 단백질, 유전체, 및 대사체를 포함하는 복합 나노입자를 분비한다[1]. 세포외 소포는 지질막 이중층으로 둘러싸인 구조로, 생성 과정에 따라 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome) 등 다양한 이름으로 불리고 있다(Table 1). 엑소좀은 주로 30 nm에서 100 nm의 크기로 세포 내 다중소포 엔도좀(multivesicular endosome)에서 기원하며, 이 다중소포 엔도좀이 세포막과 융합하면서 내강소포(intraluminal vesicles)를 세포외 공간으로 방출하는 방식으로 분비된다[2]. 초기 엔도좀에서 다중소포 엔도좀이 형성되는 과정은 엔도좀 분류 복합체(endosomal sorting complexes required for transport, ESCRT)에 의해 매개되거나[3], 스핑고미엘린 분해효소(sphingomyelinase)에 의해 스핑고미엘린(sphingomyelin)이 세라마이드(ceramide)로 변환되는 과정을 통해 막 지질이 변형되면서 내강 소포가 생성되고 이 소포가 세포외로 분비된다[4]. 엑토좀은 크기가 100 nm에서 1 μm에 이르는 비교적 큰 세포외 소포로, 세포막에서 직접 출아(budding)하여 방출된다[5]. 이러한 생성 과정은 액틴 세포골격(actin cytoskeleton) 재배열과 밀접하게 연관되어 있으며, 이는 막의 출아 및 절단(fission)을 촉진하여 엑토좀의 분비를 유도한다[6].
세포외 소포의 대표적인 표지 단백질로는 CD9, CD63, CD81과 같은 테트라스패닌(tetraspanin)이 있으며, 이는 세포외 소포를 식별하는 주요 마커로 널리 사용된다[7]. 특히, 엑소좀은 TSG101, ALIX, 및 Syntenin-1이 높은 양으로 포함되어 있으며 엔도좀 및 ESCRT 경로와 연관이 있다. 반면, 엑토좀은 인테그린(integrin)과 같은 세포막 단백질을 상대적으로 많이 포함하고 있으며, annexin A1과 BSG가 엑토좀의 특정 마커로 보고되었다[8-10]. 그러나 이러한 분자 마커들은 세포외 소포의 하위 유형을 명확하게 구별하는 절대적인 특이성을 가지지않으며, 일부는 서로 중첩되어 나타난다[10]. 또한, 세포외 소포는 크기, 분자 조성, 표면 전하 등의 측면에서 높은 이질성을 보이므로, 개별 세포외 소포의 하위군이 방출된 후 정확하게 분리하는 것은 기술적인 어려움이 있다[11]. 이러한 한계를 고려하여, 국제 세포외 소포 학회(International Society of Extracellular Vesicles,ISEV) (https://www.isev.org)는 생성 기전에 따른 세포외 소포의 분류보다는 포괄적인 개념인 “세포외 소포”라는 용어를 사용할 것을 권장하며, 엑소좀 및 엑토좀과 같은 명칭은 해당 세포외 소포가 엄격한 기준을 통해 검증된 경우에만 사용할 것을 권고하고 있다[12]. 현재, 세포외 소포의 명명은 국제 세포외 소포 학회에서는 세포외 소포를 영어로 extracellular vesicles, 한국 엑소좀 학회(Korean Society of Extracellular Vesicles, KSEV)(https://ksev.or.kr)는 세포밖 소포체, 그리고 식품의약품안전처(식약처)에서는 세포외 소포로 명명하고 있다.
과거에는 세포 간 정보 교환이 성장 인자, 사이토카인, 호르몬과 같은 단일 분자의 분비를 통해 이루어진다고 알려졌으나, 최근 연구에서는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 인간 세포(human cell)를 포함한 대부분의 세포가 수십–수백 nm 크기의 세포외 소포를 분비하여 정보교환의 매개체로 활용함이 밝혀졌다[13,14]. 세포외 소포는 단백질, 지질, 유전체, 대사체, 탄수화물 등 다양한 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있으며, 세포 성장 활성, 면역 반응 조절, 대사 활성, 혈관 신생, 암세포의 침윤과 전이 촉진 등 생리 및 병리학적 기능을 수행하는 것이 확인되었다[15-17]. 이는 세포 내 물질 수송이 소포(vesicle) 및 소포체(endoplasmic reticulum) 네트워크를 통해 특정 세포 내 장소로 이동하는 것과 유사하게, 세포외 소포 또한 모세포에서 분비된 후 표적 세포 및 특정조직으로 물질을 정확하게 전달할 수 있는 특성을 가짐을 의미한다[18]. 또한, 세포외 소포는 분비하는 모세포의 특성과 상태를 반영하기 때문에, 그 성분을 분석함으로써 질병 진단이 가능하다[19,20]. 지질 이중층으로 감싸져 있어 친수성(hydrophilic) 및 소수성(hydrophobic) 물질을 포함할 수 있기 때문에 치료 물질 및 약물을 탑재하여 암을 포함한 난치성 질환 치료를 위한 물질 수송체로활용할 수 있다[21-23].
이처럼 세포외 소포는 모세포가 가진 다양한 생체 물질을 포함한 복합체로, 분비 후 전신 순환계를 통해 이동하며 모세포의 상태를 반영하고, 표적 세포의 신호전달 체계를 활성화하여, 모세포의 분비 물질을 효과적으로 전달하는 기능을 가진다. 최근 나노 크기의 세포외 소포체 분리 및 분석 기술이 급속도로 발전하면서, 세포외 소포의 다양한 생물학적 기능과 생체활성 효과가 밝혀지고 있으며[24], 이를 질병 진단, 치료제 개발 및 약물 전달 시스템으로 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다[25,26].
특히, COVID-19 팬데믹 이후 RNA 및 DNA 기반 백신개발이 가속화되고, 글로벌 제약사들은 mRNA 백신을 포함한 유전체 의약품이 감염병, 희귀질환 및 항암 치료의 핵심이 될 것으로 전망하고 있다[28,29]. 따라서, 물질을 선택적으로 포함하여 표적 세포에 전달할 수 있고, 높은 생체 적합성을 가지는 세포외 소포에 대한 연구 및 개발수요가 지속적으로 증가하고 있다[30]. ISEV는 MISEV(Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles) 가이드라인을 통해 연구자들에게 세포외 소포의 정의 및 실험 방법을 제안하고 있다. 특히, ISEV는MISEV 발표를 통해, 엑소좀, 엑토좀 등의 특정 세포외 소포의 하위 유형에 대한 용어 대신 포괄적인 용어인 세포외 소포를 사용하는 것을 권장하고 있다. 식약처에서도 “세포외 소포 치료제 품질, 비임상 및 임상평가 가이드라인”을 통해 세포외 소포를 세포에서 분비되는 지질 이중막 구조로 정의하고, 이를 분리·정제하여 제조하는 의약품을 세포외 소포 치료제로 명시하고 있다[31]. 세포외 소포는 영문으로 extracellular vesicle로 명명되고 있으며, 국내에서 번역하는 과정에서 이를 지칭하는 용어로 세포외 소포체, 세포밖 소포체, 세포외 소포 등으로 다양하게 사용되고 있다. “Extracellular”의 용어의 경우, “세포밖” 또는 “세포외”로 번역될 수 있으나, “세포밖”의 경우는 한자 어원의 “세포”와 한글 어원의 “밖”의 혼합 용어이고, “세포외”의 경우는 한자 어원으로만 구성되어 있다. 두 번역 중 적절한 것을 선택하기 위해 유사 단어인 “extracellular matrix”를 살펴보면, 한국 생화학분자생물학회에서 발행하는 분자·세포생물학백과에서는 “세포외 기질”로 정의하고 있다. 따라서, “Extracellular”는 “세포외”의 용어를 사용하는 것이 일관성이 있다. “Vesicle”의 경우, 소포, 소포체, 소낭, 수포, 액포 등으로 번역될 수 있으나, KSEV 및 식약처에서는 각각 “소포체” 또는 “소포”로 사용하고 있다. “소포체”의 경우 분자·세포생물학백과를 포함한 다수의 사전에서 “endoplasmic reticulum”을 지칭하고 있기 때문에, 중복 지칭의 문제가 있다. 따라서, “vesicle”은 “소포”로 사용하는 것이 용어 지칭에 혼돈이 없다. 또한, 식약처 가이드라인에서 사용하는 세포외소포는 “extracellular vesicle”의 영어 단어에서 사용되는 띄어쓰기가 반영되지 않아, 본 논문에서는 “extracellular vesicle”을 띄어쓰기를 포함하는 “세포외 소포”의 용어로 사용한다.
세포외 소포가 생물학적 시스템에서 다양한 기능을 하는 이유는 세포외 소포가 가진 구성의 복잡성에서 기인한다[12]. 따라서 ISEV는 MISEV에서 세포외 소포의 정의와 분류, 분리, 특성 분석, 공학적 변형 및 임상 응용과 관련된 최적의 연구 방법을 제시하고 있다. 이를 통해, 연구자들은 각 연구 목표와 응용 분야에 따라 표준화된 연구 방식을 따를 수 있도록 정보를 제공하고 있다[12,32]. ISEV는 2011년 설립된 국제 학술 단체로, 연례 학술대회, 주제별 워크숍, 온라인 교육 플랫폼 및 타 학술 단체와의 협업을 통해 전 세계 연구자들과 교류하며, 세포외 소포 연구의 표준화 및 과학적 발전을 주도하고 있다. 2014년에 발표된 MISEV2014에서는 세포외 소포 분석의 신뢰성을 확보를 목적으로 내용이 구성되어 있으며[32], 이후 2018년에 발표된 MISEV2018에서는 세포외 소포 연구 방법론을 보다 심층적으로 평가해 세포외 소포의 특성 분석의 신뢰성을 높이기 위한 실험적 접근 방안을 제시하였다[33]. 세 번째 개정판인 2023년 발표된 MISEV2023에서는 이전 권장 사항을 더욱 정교화했으며, 세포외 소포 명명법, 전처리 변수, 분리 및 특성 분석, 방출, 흡수 및 기능 분석에 대한 in vitro 및 in vivo 연구 방법을 추가적으로 포함하고 있다[12]. 이러한 MISEV 발표를 통해, ISEV는 세포외 소포 연구 분야의 전문가 권장 사항을 발표하고 있으며, 세포외 소포 연구의 엄격한 기준과 재현성을 높이기 위해 지속적인 노력을 기울이고 있다. 또한, 세포외 소포 연구의 표준화를 위한 EV-TRACK (transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research) 데이터베이스(https://evtrack.org)를 활용할 것을 권장하고 있으며, 연구의 신뢰성, 재현성 및 투명성을 강화하는 것을 목표로 하고 있다. 본 리뷰는 MISEV2023의 주요 내용을 정리하고 보완했으며, 특히, 식약처 가이드라인을 참고하여 국내 세포외 소포 연구자들이 연구 목적과 응용 분야에 따라 최적의 연구방법을 적용하거나 개발할 수 있도록 돕는 것을 궁극적인 목적으로 한다.

영어초록

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed particles that contain diverse molecular components, such as proteins, nucleic acids, and lipids. EVs reflect the state of their cell of origin in intercellular communication. Such characteristics of EVs demonstrate their potential as biomarkers and therapeutic agents in basic and translational research. Research on EV biology and applications has progressed significantly. However, challenges remain in translating their potential into clinical applications because of issues in nomenclature, the separation of EVs from nonvesicular extracellular particles, and methods for characterization and functional analysis. The International Society for Extracellular Vesicles addresses the current standards and challenges in this rapidly evolving field through periodical updates of its Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV), which was published in 2014 and revised in 2018. The latest revision, MISEV2023, provides an updated overview of the current methodologies, detailing their strengths and limitations in EV production, separation, and characterization from various sources, including cell cultures, body fluids, and solid tissues. In this review, we summarize the fundamental principles of EV research by referencing the guidelines on EVs published by the Ministry of Food and Drug Safety of the Republic of Korea. Furthermore, we elaborate on the key aspects of MISEV2023, providing information for domestic EV researchers in selecting or developing optimal research methodologies according to their specific objectives and applications.

참고자료

· 없음