생물전공실험 수업 정리 내용

최초 등록일
2016.06.22
최종 저작일
2016.01
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(1) Immobilized metal affinity chromatography (IMAC)
IMAC는 divalent metal cations (보통 Ni2+)에 대한 polyhistidine의 친화도를 기반으로 metal chelating complex를 chromatography resin에 형성하기 위함이다. 고정된 divalent metal ion과 강한 결합을 갖는 자연적인 단백질들은 별로 없기 때문에 recombinant polyhistidine-labeled protein들은 굉장히 purity 높게 정제될 수 있다. IMAC 동안 보통 polyhisdine tag이 사용가능한지, metal ion을 어떤 종류로 쓸지 pH와 buffer 조성은 어떻게 할지 그리고 wash와 elution을 어떻게 할지 등이 고려된다. IMAC resin들은 여러 가지 format들로 사용될 수 있다. gravity flow, centrifuge column 그리고 Fast Performance Liquid Chromatography(FPLC) system 등이 있다. 이 IMAC를 이용하려면 발현한 단백질은 soluble protein이어야 하며 insoluble한 경우 Urea를 통해 denaturing condition으로 정제하기도 한다.

(2) Imidazole and elution methods
resin에 target protein이 binding하는 동안 낮은 농도의 imidazole이 보통 nonspecific interaction을 줄이기 위해 첨가된다. 보통 IMAC buffer들의 ionic strength은 비교적 높게 해서 nonspecific electrostatic interactions이 contaminants와 metal ion사이에 적게 일어나게 한다. binding과 wash buffer의 pH는 7-8로 사용되며 이는 histidine들이 metal chelation이 적절하게 일어날 수 있게 unprotonated state를 유지하기 위함이다.

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