소개글
"Infusion cloning"에 대한 내용입니다.
목차
1. 박테리아의 형질전환
1.1. 배지의 제조
1.2. Competent cell의 제조
1.2.1. Fresh 또는 frozen 방법
1.2.2. Calcium chloride를 이용한 방법
1.2.3. Ultra-competent cell의 제조
1.3. 박테리아의 형질전환
1.4. 실험 절차
1.5. 실험 결과
1.6. 실험 고찰
2. 비만과 leptin의 연관관계
2.1. 서론
2.2. leptin
2.2.1. leptin의 발견
2.2.2. leptin의 수용체와 기능
2.3. leptin과 insulin의 관계
2.4. leptin과 뇌
2.5. Barouch et al의 연구 결과
2.6. Barouch et al의 연구에 대한 고찰
2.7. leptin의 기능
2.8. leptin과 insulin 신호전달
3. 참고 문헌
본문내용
1. 박테리아의 형질전환
1.1. 배지의 제조
Plate는 박테리아가 자랄 수 있는 최적의 환경이어야 한다. 박테리아는 plate 상에서 자라 colony를 형성하는데, 한 개의 colony는 한개의 clone으로부터 자란 것이므로 이를 분획하여 여러 실험에 사용할 수 있게 된다. Plate의 조성은 배양시 사용하는 액체 배지(media)의 조성에 agar를 첨가한 것이다. 이때 첨가하는 agar의 농도는 1.5%이며, top agar와 같은 특수한 용도로 사용하기 위해서는 agar의 농도를 변화시키기도 한다.
실험방법으로 우선 배지를 만들어야 하는데, 대표적인 LB 배지(Luria-Bertani medium)의 경우 1 liter당 bacto-tryptone 10 g, bacto-yeast extract 5 g, NaCl 10 g이 필요하다. 이 성분들을 950 ml의 증류수에 녹인 후 pH를 7로 맞추기 위해 5 N NaOH를 약 200 μl 첨가하고 증류수로 1 liter로 채운 다음 autoclave한다. 이밖에도 TB배지, SOB배지, SOC배지, M9 minimal배지, Brain infusion배지 등이 있다.
액체 배지로 plate를 만드는 경우 autoclave를 하기 전에 최종농도 1.5%가 되도록 agar powder(15 g/liter)를 첨가한다. 이후 15 lb/sq로 20분 이상 autoclave한다. 배지가 적당히(65°C 정도) 식을 때까지 기다린 후 필요하면 ampicillin을 60 μg/ml가 되도록 첨가하고 잘 흔들어 섞는다. 이때 ampicillin은 가루를 증류수에 녹여 50~100 mg/ml의 농도로 만들고 filter 후 1 ml씩 분주하여 -20°C에 보관한다.
마지막으로 배지를 petridish에 조심스럽게 붓고 기포가 생기면 달구어진 loop를 이용하여 제거한다. 하루정도 상온에 놓아둔 후 wrap으로 잘 싸서 4°C에 뒤집어서 보관한다. 배지의 온도가 너무 높으면 ampicillin의 활성이 떨어지고, 배지가 너무 식으면 plate를 제조하는 도중 배지가 굳을 가능성이 있으므로 적당한 온도에서 작업할 수 있도록 한다.
1.2. Competent cell의 제조
1.2.1. Fresh 또는 frozen 방법
Fresh 또는 frozen 방법을 이용한 competent cell의 제조는 Hanahan(1983)에 의해 개발된 방법으로 DH1, DH5, MM294 등의 E. coli 균주를 높은 효율로 형질전환할 수 있다. 이 방법은 다른 균주에서는 약 5~10배 정도 효율이 떨어지지만, MC1061 등의 일부 균주에서는 형질전환이 잘 되지 않는다.
실험 방법은 다음과 같다. 먼저 LB 또는 SOB 평판에서 자란 E. coli DH5α 콜로니를 SOB 배지에 접종하여 하룻밤 동안 배양한다. 이때 효율을 높이기 위해 -70°C deep freezer에 보관한 frozen bacterial stock에서 새로 평판을 만들어 사용한다. 다음으로 이 배양액을 다시 SOB 배지에 접종하여 O.D.600이 0.4가 되도록 배양한다. 이후 배양액을 4개의 50 ml conical tube에 나누어 넣고 얼음에 10분간 방치한다. 그 다음 4,500 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 배양 부피의 1/3에 해당하는 frozen storage buffer(FSB)를 이용해 세포 침전물을 부유시킨다. 이후 두 tube씩 합쳐 30 ml로 만들고 다시 얼음에 10분간 두었다가 같은 방법으로 원심분리한다.
이번에는 처음 배양 부피의 1/12.5에 해당하는 FSB로 세포를 부유시키고, 두 tube를 합쳐 16 ml로 만든다. 여기에 DMSO를 3.5%(v/v) 첨가하고 얼음에 5~15분간 둔 뒤, 다시 DMSO를 7%(v/v)로 맞추고 10~15분간 얼음에 둔다. 마지막으로 미리 차게 해둔 microcentrifuge tube에 200 μl씩 분주하여 -70°C deep freezer에 보관한다. 이렇게 만든 competent cell은 상온에 녹았다가 다시 보관할 경우 효율이 크게 감소하므로 사용 즉시 버려야 한다.
이 방법으로 제조한 competent cell은 일반적으로 높은 형질전환 효율(약 5×108 transformed colonies/μg of supercoiled DNA)을 보이지만, 균주에 따라 크게 차이가 날 수 있다. 또한 분주하여 -70°C에 보관하면 2~3개월간 효율 감소가 크지 않다는 장점이 있다.
1.2.2. Calcium chloride를 이용한 방법
Calcium chloride를 이용한 competent cell의 제조는 이 방법이 Cohen 등에 의해 개발된 방법을 약간 변형한 것으로, 효율은 Hanahan 방법에 비해 떨어지지만 간편하고 보통 cloning 목적으로 사용하기에는 충분하므로 실험실에서 많이 사용되는 방법이다. 이 방법으로 만든 competent cell은 시간이 오래 지날수록 형질전환 효율이 다소 감소하긴 하지만 -70°C deep freezer에 보관하여 사용할 수 있다.
실험 방법은 다음과 같다. 첫째, LB plate에 자란 DH5α colony를 LB 배지 2 ml에 접종한 후 밤새 키운다. 둘째, 위에서 키운 배양액 1 ml을 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600이 0.4가 될 때까지 37°C shaking incubator에서 키운다. 셋째, 배양액을 50 ml conical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둔다. 넷째, 4°C에서 4,500 rpm으로 10분간 원심분리한다. 다섯째, 상층액을 완전히...
참고 자료
http://www.carolina.co.kr/edvotek/cat/cat201.htm
Molecular Biology 2nd (Robert F. Weaver)
Reference
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7) Halaas JL, Gajiwala KS, Maffei M, et al. Weight reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science (1995) 269:543-546
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11) http://www.bioteach.ubc.ca/Biomedicine/leptins/
